Dosisabhängiger Einfluss von Combretastatin A-4 auf das Wachstum humaner, aortaler, glatter Muskelzellen

Abstract

Dosisabhängiger Einfluss von Combretastatin A-4 auf das Wachstum humaner, aortaler, glatter Muskelzellen

Thema der Dissertation ist der dosisabhängige Einfluss von Combretastatin A-4 (CA-4) auf das Wachstum humaner, aortaler, glatter Muskelzellen (HASMC). Die HASMCs spielen eine besondere Rolle beim Restenosemechanismus, insbesondere nach stattgehabter percutaner transluminaler Angioplastie (PTA). CA-4 gehört zur Stoffgruppe der Combretastatine, die den Tubulin-bindenden Stoffen zugerechnet werden. Combretastatine zeigen eine strukturelle Ähnlichkeit mit Colchizin, verfügen jedoch über eine höhere Affinität zu den Colchizinbindungsstellen auf dem Tubulin als Colchizin selbst. Sie inhibieren die Mikrotubulusaktivität und verhindern somit ein Zellwachstum sowie eine Zellvermehrung.

Zur Untersuchung der wachstumshemmenden Wirkung des CA-4 wurden u.a. als methodische Mittel die Proliferationskinetik (PK), der Koloniebildungstest (KOBI = klonogene Aktivität) und die Durchflußzytometrie verwendet.

In der Proliferationskinetik wurden die HASMCs in einer Untersuchungsgruppe einmalig (Einfach-Behandlung) und in einer anderen Untersuchungsgruppe kontinuierlich (Dauer-Behandlung) nach entsprechenden Medienwechseln (MW) - jeweils alle 4 Tage und erneuter Zugabe von CA-4 - anbehandelt. Hierbei zeigte sich im Vergleich zur Kontrolle (unbehandelt) für die geringste Dosis (0.5x10-9 M, s. Abb. 3, Tab. 5 und 6) sowohl in der Einfach-Behandlung als auch Dauer-Behandlung nahezu keine inhibierenden Effekte auf das Proliferationsverhalten der HASMCs. Deutlicher erkennbar wirkte sich der inhibierende Effekt ab einer Dosis von 2.5x10-9 M (Abb. 3, Tab. 5 und 6) aus. Hier zeigte sich bereits eine merkliche Abnahme des Proliferationsverhaltens der Zellen mit flacherem Wachstumsanstieg und demzufolge niedrigeren Zellzahlen im Vergleich zur Kontrollgruppe in beiden Behandlungsformen. Der Übergang in ein Plateau, das „steady-state“ (Zellproliferation = Zelluntergang), wurde auf einem niedrigerem Zellzahlenniveau (s. Tab. 5 und 6) in beiden Behandlungsformen erreicht. Die Zellen mit der Höchstdosis 5x10-9 M (s. Abb. 3, Tab. 5 und 6) erfuhren eine erhebliche Hemmung der Proliferation. Die „Einfach-behandelten“ Zellen, zeigten nach den regelmäßigen Stopptagen mit MW, eine langsame Erholungstendenz, wenngleich auf deutlich niedrigerem Niveau. In der Gruppe der „Dauer-behandelten“ Zellen trat ein kompletter Wachstumsstopp ein (s. Tab 6) mit geradem Kurvenverlauf auf Höhe des Ausgangswert Tag 0. Der Kurvenverlauf in der Einfach-Behandlung nimmt hingegen einen erheblich flacheren, exponentiellen Verlauf (s. Abb. 3, 5x10-9 M) an mit Übergang in eine Plateauphase. Aus den Ergebnissen sowie der Erstellung des Proliferationsmodells (s. Formel, Kap. 2.5.2) läßt sich zudem eine dosisabhängige Abnahme der Zellzahl pro 1 M des CA-4 Agens ableiten. Für beide Behandlungsarten bedeutet dies pro 1 M des CA-4 Agens, Abnahme der Zellzahl um 319.000 Zellen.

Bei der Auswertung des KOBI (untersucht die Vermehrungsfähigkeit der Zellen) wies die behandelte Zellgruppe mit 5x10-10 M CA-4 (s. Abb. 4 und 5, grüne Kurve) einen nahezu identischen Kurvenverlauf zur Kontrollgruppe auf, welches sich auch in den gemittelten KOBI-Zahlen (s. Tab. 7 und 8) beider Behandlungsgruppen (Einfach- und Dauer-Behandlung) widerspiegelte. Die mit 2.5x10-9 M CA-4 „Einfach-behandelte“ Zellgruppe zeichnete sich zu Beginn durch einen leicht herabgesetzten Kurvenbeginn (s. Abb. 4, blaue Kurve 2.5) aus im Sinne einer reduzierten klonogenen Aktivität. Mit regelmäßigem MW näherte sich die 2.5x10-9 M Kurve der Kontrollgruppenkurve allmählich an, wobei erst gegen Ende der Beobachtungsperiode das Niveau der klonogenen Fähigkeit der Kontrollgruppe erreicht wird. Dieser Effekt lässt sich auch an den absoluten KOBI-Zahlen (s. Tab. 7) beobachten. Der beobachtete Effekt in der Einfach-Behandlung mit 2.5x10-9 M CA-4 beruht auf das Auswaschen der Substanz durch die regelmäßig durchgeführten MWs. Demzufolge stellt sich eine langsame Erholung der klonogenen Aktivität ein. In der Dauer-behandelten Gruppe mit 2.5x10-9 M CA-4 setzt sich jedoch der supprimierende Effekt weiter fort. Unter der Behandlung mit 5x10-9 M CA-4 fällt bereits nach dem ersten Behandlungstag (Tag 4) sowohl für die Einfach- als auch Dauer-Behandlung (s. Tab. 4 und 5) eine komplette Aufhebung der klonogene Aktivität auf. Während bei der Einfach-Behandlung bereits nach einmaligem MW ein Wiedereinsetzen der klonogenen Aktivität zu verzeichnen war, hielt unter der Dauer-Behandlung die vollständige Suppression an.

Um den Wirkmechanismus des Zytostatikums CA-4 in der Proliferationsphase genauer zu betrachten, erfolgte die Untersuchung des Zellzyklusses mit Hilfe der Durchflusszytometrie (s. 2.7 Zellzyklusanalyse). Während die meisten Zellen, sowohl der Kontroll-HASMCs, als auch der behandelten Zellgruppen (Einfach/Dauer: 0.5x10-9 M bzw. 2.5x10-9 M CA-4) sich am Anfang der Beobachtung in der G1-Phase befanden, stellte sich im weiteren Beobachtungsverlauf eine zunehmende Phasenverschiebung zugunsten der G2/M-Phase (s. Tab 10) ein. Im Gegensatz dazu befanden sich bereits zu Beginn der Beobachtungsphase, die mit 5x10-9 M CA-4 behandelten Zellen (s. Tab. 10), mehrheitlich in der G2/M-Phase. In beiden Behandlungsgruppen kam es zu einem verzögerten Shift der Phasenverschiebung in Richtung G1-Phase. So fanden sich mehrheitlich erst am 6. Beobachtungstag der „Einfach-behandelten“ Zellen (s. Tab. 10) in der G1-Phase, wohingegen die Phasenverschiebung in der „Dauer-behandelten“ Zellgruppe erst am 14. Tag zu verzeichnen war. Während jedoch mit der Phasenverschiebung in der „Einfach-behandelten“ Zellgruppe auch mehr Zellen, im Zuge des Substratwechsels und der daraus resultierenden langsamen Erholung, in die S-Phase übergingen, fand sich bei den „Dauer-behandelten“ Zellen (s. Tab. 10) kein vermehrter Übergang in die S-Phase.

Die gewonnenen Daten belegen einen konzentrationsabhängigen Einfluss des CA-4 auf den Wachstumsverlauf der HASMCs. Unter der mittleren Behandlungsdosis (2.5x10-9 M) mit CA-4 ist bereits eine merkliche Reduktion der PK sowie der klonogenen Aktivität zu erkennen, welche sich unter der Einfach-Behandlung langsam auf Kontrollniveau erholt, jedoch unter der Dauer-Behandlung sich stetig auf einem etwas niedrigerem Niveau einpegelt. Unter der Höchstdosis (5x10-9 M) zeigt sich bei „einmaliger Behandlung“ nach anfänglicher kompletter Suppression und anschließend regelmäßig durchgeführten MWs eine stark verlangsamte Erholung sowohl der PK als auch der klonogenen Aktivität. Wohingegen unter der Dauer-Behandlung ein vollständiger Stopp der Proliferationsfähigkeit sowie klonogenen Aktivität zu verzeichnen ist. Die Inhibierung der Zellen durch das CA-4 findet hierbei in der G2/M-Phase statt.