Nachweis von Punktmutationen im TNF-alpha- und INF-gamma-Promotor bei Patienten nach allogener Stammzelltransplantation oder Knochenmarktransplantation

Abstract

Allogene stammzelltransplantierte Patienten sind einem höherem Risiko für opportunistische Infektionen und andere Komplikationen ausgesetzt. Dabei spielt CMV eine wichtige Rolle und trägt zur Mortalität bei. Eine weitere gefürchtete Komplikation nach allogener Stammzelltransplantation ist die akute und chronische Graft-versus-Host-Disease. Angesichts der Rolle der Zytokine als Mediatorstoffe der Immunantwort ist es wichtig, ihren Einfluß auf den Auftritt und Verlauf der CMV-Infektionen und GvHD zu untersuchen. Besonderes Interesse präsentieren die Promotorregionen der Gene der Zytokine, die die Effizienz und den Zeitpunkt der Durchführung der Transkription beeinfußen können. Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Suche nach Basenveränderungen in den Promotoren von Tumor-Nekrose-Faktor-alpha und Interferon-gamma und der Vergleich der Häufigkeit ihres Auftritts bei Patienten mit oder ohne CMV-Seropsitivität vor allogener Transplantation peripherer Blutstammzellen oder Knochenmarks und bei Patienten nach allogener Stammzelltransplantation mit oder ohne CMV-Infektion bzw. GvHD. Für diesen Zweck wurden DNA-Proben von stammzelltransplantierten Patienten retrospektiv untersucht. Dabei wurde die DNA-Extraktion an EDTA-antikoagulierten Blutproben durchgeführt. Anschließend fand die Amplifikation der Human-DNA statt. Die PCR-Amplifikationsprodukte wurden ihrer Größe nach in einem Agarosegel mittels Elektrophorese aufgetrennt und aufgereinigt. Dann erfolgte die Sequenzierungs-PCR und die Aufreinigung der Sequenzierungs-PCR-Produkte. Schließlich wurde die Sequenzierung durchgeführt. Polymorphismen konnten an den Positionen -308, -238 und -376 des TNF-alpha-Promotors und an der Position -765 des IFN-gamma-Promotors nachgewiesen werden. Dabei wurde zwischen dem Genotypus G/A und G/G sowohl für die Position -308 als auch für die Positionen -238 und -376 vom TNF-alpha-Promotor unterschieden. An der Stelle -765 des IFN-gamma-Promotors war der C versus G Polymorphismus vorhanden. Der -308-G/A-Genotypus der TNF-alpha-Promotor-Region kommt unter den immungeschwächten Patienten in dieser Arbeit leicht häufiger bei den vor SCT CMV-seronegativen Patienten vor als bei den vor Stammzelltransplantation CMV-Seropositiven (43% vs 28%, x2=0,891, p=0,345, f=1, Anzahl der untersuchten Patienten=39) und deutlich häufiger bei Patienten ohne vorgekommene CMV-Primärinfektion oder Reaktivierung nach SCT als bei Patienten mit aufgetretener CMV-Infektion nach SCT (41% vs 20%, x2=1,973, p=0,160, f=1, Anzahl der Patienten=37). Die Häufigkeit vom -238-G/A-Genotypus ist leicht größer bei den vor SCT CMV-Seronegativen (14% vs 8%, x2=0,385, p=0,535, f=1, Anzahl der Patienten=39) und bei den Patienten ohne CMV-Erstinfektion oder Reaktivierung nach SCT (18% vs 10%, x2=0,460, p=0,498, f=1, Anzahl der Patienten=37). Einer der vor SCT CMV-seronegativen Patienten, der nicht nach SCT an CMV-Infektion erkrankte, hat den Genotypus G/A an der Position -376. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Gruppen von an GvHD erkrankten Patienten gebildet. Von diesen zwei Gruppen schließt eine die an GvHD 0-I max. Grades Erkrankten und die andere die an GvHD II-IV max. Grades Erkrankten ein. Die Häufigkeit vom -308-G/A-Genotyp der TNF-alpha-Promotor-Region zeigt keine Assoziation mit dem Grad der akuten GvHD (29% vs 29%, x2=0,003, p=0,955, f=1, Anzahl der Patienten=38). Die Häufigkeit vom TNF-238-G/A-Genotypus hingegen nimmt mit steigendem Grad der akuten GvHD ab (18% vs 5%, x2=1,656, p=0,198, f=1, Anzahl der Patenten=38). Der Genotypus G/A an der Position -308 des TNF-alpha-Promotors ist bei 27% (3/11) der Patienten mit schwerer chronischer GvHD vorhanden und der Genotypus G/A an der Position -238 tritt bei 18% (2/11) der Patienten mit schwerer chronischer GvHD auf. In den untersuchten IFN-gamma-Promotor-Regionen kommen bei den Patienten mit oder ohne CMV-Primärinfektion oder Reaktivierung nach SCT, bei den Patienten mit oder ohne CMV-Seropositivität vor SCT und bei den Patienten mit chronischer GvHD keine Punktmutationen vor. Bei einem der 30 erkrankten Patienten an einer akuten GvHD 0-I. max. Grades tritt der Genotypus C/G an der Position -765 auf. Eine bewiesene Assoziation der Polymorphismen der Gene der Zytokine mit der CMV-Infektion oder GvHD wäre zweifellos wichtig und könnte als Voraussagefaktor dieser Krankheiten betrachtet werden. Zusammen mit anderen Faktoren könnte das die Entwicklung von einem individuellen Risikoindex für diese Erkrankungen und den Einsatz einer passenden Therapie erlauben. In dieser Arbeit konnte im Allgemeinen kein signifikanter Zusammenhang bewiesen werden.

Following allogene stem transplantation patients undergo a higher risk opportunist infections and other complications. In this framework, cytomegalyvirus plays an important role contributing to mortality. An additional complication following allogene stem cell transplantation is acute und chronic Graft-versus-Host-Disease. Taking into account the role of the cytokines as mediator-substances of the immune response, it is significant to investigate their influence in the appearance and progress of CMV-infections and GvHD. Particular interest present the promoter-areas of cytokine-gens, which may influence the effectiveness and the actual time of DNA-transcription realization. The aim of the present assignment is the search of base-changes in the promoters of TNF-alpha and IFN-gamma and the comparison of appearance frequency in patients with or without CMV-seropositivity before the allogene transplantation of peripheral blood stem cells or the bone marrow and in patients after allogene SCT with or without CMV-infection or GvHD. For this purpose, retrospective DNA samples of patients who went under SCT were examined. The DNA extraction was performed from EDTA-anticoagulated blood specimens. Amplification of human DNA took place at a second stage. The PCR-amplification products were divided in an agarosegel through electrophoresis and were cleared away. Then PCR for sequence analysis and the filtering of PCR products were conducted. Finally, sequence analysis was performed. Polymorphisms were found in positions -308, -238 and -376 of TNF-alpha-promoter as well as in position -765 of IFN-gamma-promoter. Genotypes G/A and G/G were detected in position -308 as well as in positions -238 and -376 of TNF-alpha-promoter. In position -765 of IFN-gamma-promoter C versus G polymorphism was evident. In this assignment, the -308-G/A genotype of TNF-alpha-promoter-area appears in immunerepressed patients slightly more frequent in CMV-seronegative patients before SCT compared to patients who were CMV-seropositive before SCT (43% vs 28%, x2=0,891, p=0,345, f=1, number of examined patients=39) and obviously more frequently in patients who didn’t suffer primary CMV-infection or re-activation after SCT in comparison to those who suffered CMV-infection after SCT (41% vs 20%, x2=1,973, p=0,160, f=1, number of patients=37). The -238-G/A-genotype frequency is slightly higher in CMV-seronegative patients before SCT (14% vs 8%, x2=0,385, p=0,535, f=1, number of patients=39) and in patients without primary CMV-infection or re-activation after SCT (18% vs 10%, x2=0,460, p=0,498, f=1, number of patients=37). One of the CMV-seronegative patients before SCT who didn’t suffer CMV-infection after SCT has a G/A genotype in position -376. In this assignment, two groups of patients were detected in relation to GvHD. One group includes patients with GvHD 0-I maximum degree and the other group includes patients with GvHD II-IV maximum degree. The frequency of -308-G/A-genotype of TNF-alpha-promoter-area doesn’t indicate any relation with the degree of the acute GvHD (29% vs 29%, x2=0,003, p=0,955, f=1, number of patients=38). On the other hand, the frequency of TNF-238-G/A-genotype is reduced as the degree of acute GvHD increases (18% vs 5%, x2=1,656, p=0,198, f=1, number of patients=38). The G/A genotype of position -308 of TNF-alpha-promoter is apparent in 27% (3/11) of the patients with severe chronic GvHD and the genotype G/A in position -238 appears in 18% (2/11) of patients with severe chronic GvHD. In examined IFN-gamma-promoter-areas, pointmutations do not appear in patients with or without primary CMV-infection or re-activation after SCT, in patients with or without CMV-seropositivity before SCT and in patients with chronic GvHD. In 1 out of 30 patients with severe GvHD 0-I maximum degree the genotype C/G appears in position -765. An established relation between polymorphisms of genes of cytokines and CMV-infection or GvHD would be undoubtedly significant and could be considered as prognosis factor in such patients. Together with other factors, it could allow the development of an individual indicator of damaging factors concerning these diseases and the application of relevant treatment. In general, in this assignment a statistically significant relation could not be established.