Inhibition der erythrozytären Apoptose durch Catecholamine

Abstract

Bei den Erythrozyten als kernlosen Zellen tritt eine spezielle Variante der Apoptose auf, die Eryptose, die, entsprechend der Apoptose kernhaltiger Zellen, typische Merkmale wie Phosphatidylserin-Exposition und Zellschrumpfung aufweist, was an Hand von durchflusszytometrischen Messungen des FITC-markierten Annexins V und des Forward Scatters belegt werden kann. In vitro ist die Eryptose auslösbar, indem man die Erythrozyten in einem hyperosmolarem Medium oder in einem Medium, das weder Chlorid noch Glucose enthält, inkubiert. Osmotischer Schock, oxidativer Stress oder Chloridentfernung führen mittels PGE2-Bildung zur Aktivierung der unselektiven Kationenleitfähigkeit, die zum Einströmen der Ca2+-Ionen führt. Anhand der Patch-Clamp-Technik lässt sich das genaue Verhalten der unselektiven Kationenkanäle, die die Ca2+-Leitfähigkeit beeinflussen, analysieren. Die Ca2+-Ströme lassen sich durch durchflusszytometrische Messungen an Fluo-3-AM-markierten Erythrozyten nachweisen, während man mit Hilfe der Annexinfärbung die Aktivität der Scramblase bestimmen kann, die für die Phosphatidylserinexposition verantwortlich ist. Diese Arbeit geht die Fragestellung an, ob man die Aktivierung der unselektiven Kationenleitfähigkeit und die dadurch bedingte Phosphatidylserinexposition mit den Catecholaminen beeinflussen kann. Infolge der Entfernung des extrazellulären Cl- erhielt man als signifikante Wirkung eine Zunahme der Annexinbindung und eine Abnahme der Erythrozytengrösse im Forward Scatter. Unter Einfluss des (beta) -Agonisten Isoproterenol (1 µM) zeigten diese Effekte ein deutlich reversibles Verhalten. Durch Fluoreszenzmessungen mit Fluo-3 AM konnte nach Entfernung der Cl--Ionen ein Anstieg der zytosolischen Ca2+-Konzentration nachgewiesen werden. Entsprechend der Whole–Cell-Patch-Clamp-Technik in chloridfreier Lösung durchgeführte Experimente lassen eine zeitabhängige Inaktivierung der unselektiven Kationenleitfähigkeit infolge der Zugabe von Isoproterenol (10 µM) erkennen. Phenylephrin (IC50 < 10 µM), Dobutamin (IC50approx 1 µM) und Dopamin (IC50approx. 1 µM) hemmen in ähnlicher Weise die Effekte, die nach der Chlorid-Entfernung auftreten. Abschliessend kann man sagen, dass mehrere Catecholamine den durch die Cl--Entfernung bedingten Ca2+-Einstrom in die Erythrozyten hemmen. Dadurch verhindern sie einen Anstieg des cytosolischen Ca2+-Gehalts, die konsekutiv eintretende Zellschrumpfung und die Aktivierung der Scramblase. Demzufolge kompensieren die Catecholamine die Phospha¬tidylserinexposition und die anschliessende Beseitigung der Erythrozyten aus dem zirkulierenden Blut.

Osmotic shock, oxidative stress and Cl-–removal activate a non – selective Ca2+- permeable cation conductance in human erythrocytes. The entry of Ca2+ leads to activation of a scramblase with subsequent exposure of phosphatidylserine at the cell surface. Phosphatidylserine mediates binding to phosphatidylserine receptors on macrophages which engulf and degrade phosphatidylserine exposing cells. Moreover, phosphatidylserine exposure may lead to adherence of erythrocytes to the vascular wall. In the present study, we explored whether activation of the non -selective cation conductance and subsequent phosphatidylserine exposure might be influenced by catecholamines. Phosphatidylserine exposure has been determined by FITC – annexin binding and decreased forward scatter, an effect significantly blunted by the (beta) agonist isoproterenol (IC50 approx 1 µM). Fluo – 3 fluorescence measurements revealed an increase of cytosolic Ca2+ activity following Cl- removal, an effect again significantly blunted by isoproterenol exposure (10 µM). Whole cell patch – clamp experiments performed in Cl - free bath solution indeed disclosed a time–dependent inactivation of a non–selective cation conductance following isoproterenol exposure (10 µM). Whole – cell patch–clamp experiments performed in Cl--free bath solution indeed disclosed a time-dependent inactivation of a non-selective cation conductance following isoproterenol exposure(10 µM), Phenylephrine(IC50 < 10 µM), dobutamine (IC50 approx. 1 µM) and dopamine (IC50 approx. 3 µM) similarly inhibited the effect of Cl--removal on annexin binding and forward scatter. In conclusion, several catecholamines inhibit the Cl--removal –activated Ca2+-entry into erythrocytes, thus preventing increase of cytosolic Ca2+- activity, subsequent cell shrinkage and activation of erythrocyte scramblase. The catecholamines thus counteract erythrocyte phosphatidylserine exposure and subsequent clearance of erythrocytes from circlating blood.