Selektionierte Phagen als Modell für peptid-abhängigen Makromolekültransport. Einsatz von Phagendisplaybibliotheken an der gastrointestinalen Mukosa

Abstract

Der Einsatz von Phagendisplaybibliotheken wurde in der vorliegenden Arbeit erstmals in vivo über die gastrointestinale Schranke untersucht und zum nationalen und internationalen Patent angemeldet (DE_198_45_251_A1, PCT/EP99/05453). Phagendisplaybibliotheken finden bisher ihren Einsatz in der Epitopidentifizierung von Zielstrukturen. Dazu werden je eine Sequenz in ein Oberflächengen von Bakteriophagen aus Bibliotheken hoher Komplexität inseriert und somit die translatierte Sequenz als Fusionspeptid auf der Oberfläche von Bakteriophagen zur Darstellung gebracht. Inserts der selektierten M13-Phagen wurden sequenziert und auf Homologie mit bekannten Proteinen und Peptiden aus Internetdatenbanken überprüft. Dabei zeigten sich Übereinstimmungen mit Hüllproteinen von HHV-7 und HIV-1, die auf neue Bindungstellen dieser invasiven Pathogene mit Wirtszellmembranen hindeuten. Der Transportweg der selektierten Phagen konnte über Enterozyten und parazellulär nachgewiesen werden, womit neue makromolekulare oder peptidinduzierte Transportwege über Haftkomplexe und Enterozyten zu diskutieren sind. Auf beiden Wegen könnten spezifische Peptide für den Transport, dessen Induktion und Selektion verantwortlich gemacht werden. Erst kürzlich begann der Einsatz von Phagendisplaybibliotheken für in vivo Experimente, wodurch Peptide selektioniert wurden, die spezifisch an Oberflächenproteine von Brustkrebsendothelzellen binden und durch Koppelung an Zytostatika eine bis zu 40fache Dosisreduzierung des Zytostatikums erreicht werden konnte. Enteral selektionierte Peptide mit transportinduzierenden Eigenschaften sind daher Kandidaten für Versuche, an orale Therapeutika gekoppelt zu werden und damit den transenteralen Wirkstofftransport zu erleichtern mit der Aussicht, die Wirkstoffdosis entscheidend zu reduzieren.

Background & Aims: Uptake of many oral pharmaceuticals is limited by the gastrointestinal barrier. Improving uptake of undegraded macromolecules by selectively targeting endogenous transport mechanism might be a tool in the development of chimeric therapeutics. Methods: In vivo display of a recombinant M13 phage library via endogastric feeding was used to select phages penetrating the rat intestinal mucosa. Uptake of recombinant phages was followed by immunochemistry. Sequences of insert peptides were compared with peptides and proteins of Genbank, PDBTM, PRF, PIR and Kabat databases. Results: By in vivo phage display recombinant undegraded infectious phages were recovered from rat spleen. The phages, which had translocated the rat mucosa, were recloned and sequenced. Immunostaining revealed specific transport by enterocytes. Sequence analysis of recombinant heptapeptides shows homology to envelope-proteins of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and human herpes virus 7 (HHV-7). Conclusions: We have demonstrated the feasibility of in vivo phage display to select phages translocating the gut mucosa undegraded. Such peptides might be novel tools in the study of peptide transport across the gastrointestinal mucosa and in the development of chimeric agents with improved uptake by the gastrointestinal tract.