Advanced target validation and development of an activity assay for inhibitor evaluation of MepM murein endopeptidases as anti-virulence and resistance-breaking targets untranslated

Abstract

Die Entdeckung der Antibiotika war ein Meilenstein in der Geschichte der Medizin. Sie führten zu einer erheblichen Verringerung der Sterblichkeitsraten und ermöglichten durch die Kontrolle infektiöser Komplikationen die Entwicklung invasiver medizinischer Behandlungen. Ihre weit verbreitete Verwendung hat jedoch auch die weltweite Entwicklung von Resistenzen gefördert, die heute eine ernsthafte Bedrohung für die globale Gesundheit darstellen. Besonders besorgniserregend sind multiresistente Gram-negative ESKAPE-Erreger wie Pseudomonas aeruginosa. Dieser verursacht schwere nosokomiale Infektionen mit hohen Sterblichkeitsraten bei immungeschwächten Patienten. Zu den wichtigsten Mechanismen der β-Lactam-Resistenz von P. aeruginosa gehören die Inaktivierung von Antibiotika durch die Überexpression der chromosomalen β-Lactamase AmpC, eine verringerte Permeabilität der äußeren Membran, ein erhöhter Efflux durch RND-Transporter sowie Veränderungen der Zielproteine, also der Penicillin-bindenden Proteinen. Unter dem Druck von Antibiotika können auch nicht-essenzielle Gene essenziell werden. Die gezielte Hemmung der entsprechenden Proteine durch Adjuvantien könnte die Empfindlichkeit resistenter Bakterien gegenüber Antibiotika wiederherstellen. In P. aeruginosa wurden die LytM/M23-Zink-DD-Endopeptidasen MepM1, MepM2 und MepM3 als vielversprechende Wirkziele einer Adjuvantien-Therapie identifiziert, da ihre Deletion die Resistenz gegenüber verschiedener bekannter und gut verträglicher β-Lactam-Antibiotika synergistisch bricht. Darüber hinaus teilen sich MepM1 und MepM2 das gleiche aktive Zentrum, sodass beide Enzyme mit einem einzigen Hemmstoff inhibiert werden könnten. Diese Arbeit konnte zeigen, dass eine verringerte β-Lactamase-Aktivität sowie überraschenderweise erhöhte MexE/MexF/OprN-Spiegel verantwortlich sind für die Verringerung der Resistenz gegen β-Lactam-Antibiotika nach Deletion von mepM. Es wird angenommen, dass erhöhte MexE/MexF/OprN-Spiegel das Quorum Sensing, die Motilität oder die Biofilmbildung beeinflussen und damit die Antibiotikaresistenz reduzieren können. Massenspektrometrische Analysen ergaben weitere potenzielle Veränderungen des Membranproteoms durch die Deletion von mepM1, mepM2 und mepM3. Dies brachte neue potenzielle Resistenzmechanismen und Funktionen von MepMs auf. Hierzu zählt die Anpassung an veränderte Umweltbedingungen durch Nährstoffaufnahme, Quorum Sensing, Motilität, Biofilmbildung und Umbau der Zellhülle. Die erfolgreiche Entwicklung von Aufreinigungsprotokollen für die rekombinanten, aktiven Enzyme PaMepM1 und PaMepM2 sowie die Herstellung von Anti-MepM-Antikörpern stellen wichtige Ressourcen für die zukünftige Forschung dar. Die Antikörper wurden zur Validierung der ∆mepM1- und ∆mepM2-Deletionsmutanten verwendet und bestätigten, dass MepM1, im Gegensatz zu MepM2, durch CtpA reguliert wird. Durch die Entwicklung funktioneller Enzymaktivitätstests konnte erstmals die Aktivität der Murein-DD-Endopeptidasen von P. aeruginosa in vitro gemessen werden, was den Weg für eine weitere enzymatische Charakterisierung ebnete. Schließlich wurde ein Hochdurchsatz-Assay zum Testen potenzieller MepM-Inhibitoren entwickelt. Die Identifizierung der ersten hemmenden Verbindung beweist die Funktionalität des Versuchsaufbaus. Angesichts der dringenden Notwendigkeit, multiresistente P. aeruginosa-Infektionen zu bekämpfen, leistet diese Arbeit einen wertvollen Beitrag zur Erforschung der Antibiotikaresistenz und zur Entwicklung neuer antimikrobieller und antivirulenter Strategien.

The discovery of antibiotics was a milestone in the history of medicine. They led to a significant reduction in mortality rates and enabled invasive medical treatments to be developed by controlling infectious complications. However, their widespread use since then has encouraged the worldwide development of resistance, which today poses a serious threat to global health. Of particular concern are multidrug-resistant Gram-negative ESKAPE pathogens, such as Pseudomonas aeruginosa, which is associated with severe nosocomial infections and high mortality rates in immunocompromised patients. Key mechanisms of P. aeruginosa β-lactam resistance include antibiotic inactivation via the overexpression of the chromosomal β-lactamase ampC, reduced outer membrane permeability, increased efflux through RND transporters and target modifications in penicillin-binding proteins. Under antibiotic pressure, non-essential genes can become essential. Targeting the corresponding proteins with adjuvants could restore antibiotic susceptibility in resistant bacteria. The LytM/M23 zinc DD-endopeptidases MepM1, MepM2 and MepM3 have been identified as promising adjuvant targets in P. aeruginosa, as deleting them breaks resistance synergistically against various well-known and well-tolerated β-lactam antibiotics. Additionally, MepM1 and MepM2 share the same active site, enabling both enzymes to be targeted simultaneously with a single inhibitor. This work demonstrated that reduced β-lactamase activity and, surprisingly, increased MexE/MexF/OprN levels are responsible for the reduced resistance to β-lactam antibiotics observed following the deletion of mepM. It is hypothesised that elevated MexE/MexF/OprN levels may affect quorum sensing, motility, or biofilm formation, thereby influencing antibiotic resistance. Analyses using mass spectrometry revealed further potential changes of the membrane proteome following the deletion of mepM1, mepM2 and mepM3. This brought up new potential resistance mechanisms and functions of MepMs including adaptation to altered environmental conditions through nutrient uptake, quorum sensing, motility, biofilm formation and remodeling of the cell envelope. The successful development of purification methods for the recombinant, active enzymes PaMepM1 and PaMepM2, as well as the generation of anti-MepM antibodies, provides important resources for future research. These antibodies were used to validate the ∆mepM1 and ∆mepM2 deletions, confirming that MepM1 is regulated by CtpA, in contrast to MepM2. The development of functional enzyme activity assays made it possible to measure P. aeruginosa murein DD-endopeptidase activity in vitro for the first time, paving the way for further enzymatic characterization. Finally, a high-throughput assay for testing potential MepM inhibitors was developed, representing a promising step towards the discovery of therapeutic agents that target MepMs. The identification of the first inhibitory compound proves the functionality of the experimental design. Considering the urgent need to combat multidrug-resistant P. aeruginosa infections, this work makes a valuable contribution to research into antibiotic resistance and the development of new antimicrobial and antivirulence strategies.