Inhaltszusammenfassung:
Die vorliegende Arbeit untersucht den Einfluss von environmental
enrichment (EE) auf transgene BACHD Ratten, welche ein murines Modell der Huntington-Erkrankung darstellen.
Angesichts der großen Variabilität von EE-Paradigmen mit im Allgemeinen positiven, aber teils
divergierenden Effekten werden zwei unterschiedliche Varianten von EE verglichen, die sich in
ihrem zeitlichen Aspekt unterscheiden. Die erste Variante besteht aus einem permanenten
environmental enrichment, während die Tiere in der zweiten Variante erst im späteren Verlauf
einem enriched environment exponiert werden. Aus translationaler Perspektive sollen diese
Ansätze zwei Szenarien modellieren und vergleichen, in denen HD-AnlageträgerInnen bereits
frühzeitig in Gesundheit bzw. Prodromalstadium einen mutmaßlich gesundheitsförderlichen
Lebensstil führen oder diesen erst später nach Krankheitsmanifestation adaptieren. Das
genutzte EE-Design intendiert eine Induktion von körperlicher Aktivität, kognitiver
Stimulierung und sozialer Interaktion. Zum besseren Verständnis der Verbindung zwischen
environmental enrichment und Progress des HD-Phänotyps wurde neben behavioralen
Messungen auch die striatale Genexpression zu zwei Alterszeitpunkten untersucht. Diese ist
von besonderem Interesse, da transkriptionelle Dysregulation einerseits einen wichtigen HD-
Pathomechanismus darstellt und bereits im Prodromalstadium mit striatalem Schwerpunkt
nachweisbar ist. Andererseits dient das Transkriptom
als zentrales Verbindungsglied, um Verhaltens- und Umwelteinflüsse in das zelluläre Programm
von Versuchstieren und HD-PatientInnen zu integrieren.
Um den Effekt von Genotyp und environmental enrichment und auf das Krankheitsmodell zu
beurteilen, wurden drei Gruppen bestehend aus Wildtyp (WT) und transgenen Ratten (BACHD)
gebildet. Die erste Gruppe fungiert als Kontroll- und Referenzgruppe, in der die Tiere dauerhaft
in Standardkäfigen in einem standard environment (SE) gehalten wurden. Ein Teil dieser
Gruppe wurde nach sechs Monaten geopfert, der andere nach zwölf Monaten. Der Genotyp der
Versuchstiere stellt die einzige systematisch manipulierte Variable in dieser Gruppe dar,
wodurch prinzipiell Kausalaussagen über den Effekt der durch das Transgen modellierten HD-
Erkrankung möglich sind. Die zweite Gruppe aus WT und BACHD Ratten wurde nach
Trennung vom Muttertier dauerhaft in einem enriched environment gehalten und aufgrund der
frühen und lebenslangen Umweltmodifikation als EEfrüh bezeichnet. Sie dient der Evaluation
des Effekts einer möglichst frühzeitigen EE-Intervention und erlaubt in Verbindung mit der
Kontrollgruppe eine Betrachtung des Transgen-Effekts in Abhängigkeit von Haltungsbedingungen. Auch die Tiere dieser Gruppe wurden nach sechs bzw. zwölf Monaten geopfert. Die dritte und letzte Gruppe bestand schließlich aus WT und BACHD Tieren, die initial wie die SE-Kohorten unter Standardbedingungen gehalten wurden, bis sie nach sechs
Monaten einem enriched environment exponiert wurden, in dem sie weitere sechs Monate bis
zur Opferung lebten. Aufgrund des verzögerten environmental enrichment wird diese Gruppe
als EEspät bezeichnet und ermöglicht die Beobachtung, welchen Effekt ein EE zu einem späteren
Zeitpunkt im Leben der Tiere hat, zu dem sich der Transgen-Effekt bereits über einen längeren
Zeitpunkt entfalten konnte. Diese Tiere wurden nach zwölf Monaten geopfert. Nach sechs
Monaten fand anders als in den vorherigen beiden Gruppen keine Opferung statt, da die
Haltungsbedingungen bis dahin identisch zu denen der Kontrollgruppe waren. Sowohl zum
Sechs- wie zum Zwölfmonatszeitpunkt wurden Verhaltensmessungen durchgeführt und die
striatale Genexpression bestimmt. Zusätzlich wurde die Gewichtsentwicklung bis zur 22.
Lebenswoche verfolgt.
Mit dem vorgestellten Versuchsaufbau bearbeitet die vorliegende Arbeit folgende
Fragestellungen und Hypothesen:
I. Effekt des Genotyps: Welche Genotyp-induzierten Unterschiede finden sich
zwischen BACHD und Wildtyp Ratten in Phänotyp und striatalem Transkriptom?
- Hypothese 1.a (gerichtet): BACHD Tiere der Kontrollgruppe zeigen in Verhaltenstests insgesamt eine schlechtere Leistung als WT Tiere
- Hypothese 1.b (ungerichtet): BACHD Tiere der Kontrollgruppe weisen eine partiell differentielle striatale Genexpression im Vergleich zu WT Tieren der Kontrollgruppe auf
II. Effekt des Alters: Zeigen die beobachteten durch das Transgen vermittelte Veränderungen einen progressiven Alterseffekt?
- Hypothese 2.a (gerichtet): Die in 1.a angenommenen phänotypischen Unterschiede sind zum Zwölfmonatszeitpunkt ausgeprägter als zum Sechsmonatszeitpunkt
- Hypothese 2.b (gerichtet): In 1.b angenommene transkriptionelle Unterschiede zwischen den Genotypen sind zum Zwölfmonatszeitpunkt ausgeprägter als zum Sechsmonatszeitpunkt
III. Modulierbarkeit des Transgen-Effekts durch environmental enrichment: Lassen sich diese Transgen-induzierten Veränderungen durch das verwendete environmental enrichment reduzieren?
- Hypothese 3.a (gerichtet): Im Vergleich der SE Tiere mit beiden EE Gruppen zeigt sich in den Verhaltensdaten eine Interaktion von Genotyp mit Umwelt zugunsten eines geringeren Transgen-Effekts unter beiden EE-Bedingungen.
- Hypothese 3.b (gerichtet): Die in 1.b angenommene differentielle Expression zwischen den Genotypen liegt in beiden EE-Gruppen reduziert vor.
IV. Effekt eines früh oder spät einsetzenden environmental enrichment: Bestehen zwischen den beiden untersuchten Varianten des enriched environment Unterschiede in dessen Modifikation des Transgen-Effekts?
- Hypothese 4.a (ungerichtet): Der in 3.a angenommene Interaktionseffekt unterscheidet sich zwischen früherer und späterer EE-Exposition.
- Hypothese 4.b (ungerichtet): Die in 1.b angenommene differentielle Expression wird durch EEfrüh und EEspät unterschiedlich stark reduziert.
Transgene Tiere präsentierten einen im Vergleich zum Wildtyp deutlich betroffenen Phänotyp,
der nicht relevant durch die unterschiedlichen Haltungsbedingungen beeinflusst wurde. Die am
stärksten beeinträchtigte Domäne fand sich im lokomotorischen Verhalten der Tiere während
der Dunkelphase des Tageszyklus. BACHD Ratten zeigten zu beiden Alterszeitpunkten ein
stark reduziertes Ausmaß lokomotorischer Aktivität. Deutliche mHTT-induzierte kognitive
Defizite zeigten sich ebenfalls sowohl in der jüngeren als auch der älteren Kohorte. Eine
moderate Steigerung Angst-bezogenen Verhaltens in BACHD-Ratten konnte zum
Zwölfmonatszeitpunkt beobachtet werden. Zusätzlich zeigten transgene Tiere eine verstärkte
Gewichtszunahme während der ersten Lebenswochen. In Gesamtschau stehen die erhobenen
Verhaltensdaten in Einklang mit der zugehörigen Hypothese.
Das auf den Tieren der SE12m Kontrollgruppe basierende Netzwerk der striatalen Koexpression
enthielt fünf in ihrer Expression signifikant vom Genotyp der Tiere beeinflusste Module. Die
Validierung des Netzwerks an internen wie externen murinen Expressionsdaten sowie an HD-
PatientInnen führte zur Selektion von zwei Modulen, die über alle betrachteten Datensätze als
konserviert angesehen werden konnten. Zusätzliche Evidenz für diese Auswahl ergab sich aus
einer Konvergenzvalidierung mit der einfachen differentiellen Genexpressionsanalyse. Die
differentielle Genexpression der Module betraf Gene, die insbesondere für gliale bzw.
neuronale Funktionen von Bedeutung sind. Für diese Gene zeigte sich ausnahmslos eine
geringere Expression in transgenen relativ zu Wildtyp Tieren. Diese Befunde stützen die in der
zugehörigen Hypothese angenommenen Zusammenhänge.
Die beobachteten phänotypischen Defizite transgener Ratten präsentierten sich zwischen den
betrachteten Alterszeitpunkten partiell progredient. Angst-bezogenes Verhalten lag zum Zwölf-
, nicht aber zum Sechsmonatszeitpunkt zwischen den Genotypen verändert vor. Kognitive
Defizite zeigten eine Tendenz zur Verschlechterung in der älteren Kohorte. Lokomotorische
Defizite schließlich waren in beiden Altersgruppen ähnlich stark ausgeprägt. Zusammengenommen lag bei älteren BACHD Ratten – wie in der aufgestellten Hypothese angenommen – ein im Mittel stärker beeinträchtigter Phänotyp vor.
Zum Sechsmonatszeitpunkt fand in den betrachteten Modulen in nur sehr geringem Maße
differentielle Expression statt. Die in der älteren Tierkohorte festgestellten deutlichen
transkriptionellen Unterschiede zwischen den Genotypen stehen hierzu in Kontrast. Im
Allgemeinen zeigte die Mehrheit der Modulgene eine altersassoziierte Änderung ihrer
Expressionsrate. Die betrachteten Pseudo-Trajektorien in den jeweiligen Modulen umfassten
im Wesentlichen dieselben Gene. BACHD Tiere konnten dabei tendenziell das Ausmaß der in
WT Tieren gezeigten Expressionsänderung nicht gleichermaßen nachvollziehen. Passend
hierzu deutete sich bei BACHD Tieren in Genen, die nur in Pseudotrajektorien eines der beiden
Genotypen enthalten waren, ein Nichtnachvollziehen von im Wildtyp beobachteten
Expressionsveränderungen an. Damit entsprechen die beobachteten den in der Hypothese
formulierten Änderungen.
Der Genotyp der Tiere hatte einen deutlichen Einfluss auf den beobachteten Phänotyp. Ein diese
Unterschiede modulierender Interaktionseffekt zwischen Genotyp und Haltungsbedingung
wurde in den Verhaltensmessungen nicht beobachtet. Vereinzelt zeigten sich milde bis moderate
Umwelteffekte, die dann stets beide Genotypen betrafen. Einzig in den PhenoMaster-Daten zur
Dunkelphase-Aktivität zeigte sich eine Interaktion beider experimentell manipulierter
Variablen. Diese ist allerdings auf Unterschiede zwischen den Wildtyp-Subgruppen
zurückzuführen und nicht auf eine veränderte Aktivität von transgenen Tieren in
unterschiedlichen Haltungsbedingungen. Insofern unterstützen die erhobenen Daten die
formulierte Hypothese nicht.
Die unter Standardbedingungen aufgetretene ausgeprägte differentielle Expression von
Modulgenen betraf unter beiden enriched environment Bedingungen nur vereinzelte Gene. In
Modul Cyan wurde Anzahl an differentiell exprimierten Genen je nach betrachtetem Vergleich
auf maximal vier und in Modul Purple auf maximal drei Gene begrenzt. Unter
Standardbedingungen wurden kontrastierend hierzu jeweils 84 (Modul Cyan) bzw. 65 Gene
(Modul Purple) in Abhängigkeit vom Genotyp unterschiedlich exprimiert. Dieser Ergebnisse
entsprechen damit dem in der Hypothese antizipierten Effekt.
Beide enriched environments unterschieden sich insgesamt nicht in ihrer Auswirkung auf den
Phänotyp transgener Tiere. Der angenommene modulierende Effekt der Haltungsbedingung
fand sich weder für frühes noch für spätes environmental enrichment. Die Hypothese kann
durch diese Ergebnisse daher nicht unterstützt werden. Sowohl frühes als auch spätes environmental enrichment konnte die
unter Standardbedingungen beobachteten mHTT-induzierten Expressionsänderungen stark reduzieren. Ein substanzieller Einfluss auf weitere Modulgene, die unter Standardhaltung keine
differentielle Expression aufwiesen, wurde nicht beobachtet. In Modul Purple wurde die
relative Änderung der Genexpression in transgenen Tieren in beiden enriched environments in
vergleichbarem Umfang reduziert. Beide Umweltinterventionen schienen damit den gleichen
normalisierenden Effekt auf die striatale Transkription gehabt zu haben. Für die Expression der
Gene in Modul Cyan zeigte sich ebenfalls für beide EE-Varianten ein entsprechender
angleichender Effekt, der unter später einsetzendem environmental enrichment stärker
ausgeprägt zu sein schien. Die beiden Umweltinterventionen scheinen daher im Sinne der
Hypothese zumindest partiell unterschiedlichen Einfluss auf die striatale Genexpression
ausgeübt zu haben.
Huntington's disease