Die Dissertation ist gesperrt bis zum 01. April 2027 !
Das CCA ist nach dem HCC der zweithäufigste primäre Lebertumor (Patel 2001). Trotz Chemotherapie liegt die mittlere Überlebenszeit bei einem fortgeschrittenen CCA bei weniger als einem Jahr (Nghiem, Wood et al. 2023). Daher besteht ein großer Bedarf an weiteren Therapieoptionen. Vielversprechend ist dabei die molekulare Therapie, denn besonders das iCCA weist häufig molekulare Veränderungen auf. Zu nennen sind hier FGFR2-Translokationen oder IDH1/2 Mutationen (Valle, Lamarca et al. 2017, Rizvi, Khan et al. 2018). Besonderes Augenmerk liegt auf den Veränderungen des Tyrosinkinaserezeptors FGFR2, welche bei bis zu 15% der iCCA-Patienten vorliegen (Vogel, Segatto et al. 2023, Katoh, Loriot et al. 2024). Spezifische FGFR-Inhibitoren, wie die Tyrosinkinase-Inhibitoren Pemigatinib, Infigratinib und Futibatinib wurden mittlerweile für CCA-Patienten mit FGFR2-Fusion zur Therapie zugelassen (Hoy 2020, Kang 2021, Khoury, Khalife et al. 2023).
FRS2 spielt eine zentrale Rolle in der Signaltransduktion im FGF-Signalweg (Sato and Gotoh 2009). Das Adapterprotein ist konstitutiv über Myristylation an der Membran gebunden. Bindet z.B. der Ligand FGF an den FGFR2 Rezeptor, wird FRS2 phosphoryliert und aktiviert intrazelluläre Signalwege wie RAS-MAPK, PI3K-AKT, PLCϒ und STAT (Eswarakumar, Lax et al. 2005, Turner and Grose 2010, Goetz and Mohammadi 2013). Diese Signalwege sind wichtig für die Zellmigration, Proliferation, das Überleben und die Differenzierung der Zelle (Turner and Grose 2010, Ornitz and Itoh 2015). Die Auswirkungen von einer FRS2-Amplifikation in CCA-Zellenlinien sollte in vitro in dieser Arbeit näher untersucht werden.
Mittels retroviraler Transfektion wurde die CCA-Zelllinie RBE genetisch so verändert, dass FRS2 stabil transfiziert wurde. Der Erfolg der Transfektion und der stabilen Amplifikation von FRS2 wurde mittels qPCR auf mRNA-Ebene, mittels Immunhistochemie, Western Blot und DigiWest auf Proteinebene bestätigt. Die funktionellen Eigenschaften wurden mit SRB-Assays, Koloniebildungsassays und Migrationsassays untersucht. Dabei führte die Transfektion von FRS2 in der RBE-Zelllinie zu Zeichen einer malignen Transformation, gekennzeichnet durch gesteigerte Proliferation, Induktion der Koloniebildung und gesteigerter Migration. Bei der CCA-Zelllinie SZ1 war dieses Vorgehen wahrscheinlich auf Grund von überlagerten Co-Mutationen nicht erfolgreich.
Die Wirksamkeit des Multikinase-Inhibitors Lenvatinib und des selektiven FGFR2-Inhibitors Infigratinib sollte daraufhin in vitro überprüft werden. Dies wurde mittels Zytotoxizitäts-Screenings Sulforhodamine B gemacht. Die FRS2-Amplifikation hat in der RBE-Zelllinie zu einer signifikant erhöhten Resistenz gegenüber Lenvatinib und Infigratinib geführt. Auch im Migrationsassay konnte die Migration nicht signifikant durch die Substanzen inhibiert werden. Unsere Daten sprechen daher gegen eine Behandlung mit TKIs bei Patienten mit FRS2-Amplifikation. Dies unterstützt auch ein Fallbericht mit FRS2-Amplifikation im Chlangiokarzinom, in dem nach einem Progress nach Erstlinienstherapie off-label eine Behandlung mit dem Multikinase-Inhibitor Lenvatinib erfolgte. Lenvatinib zeigte dabei keine Wirkung, so dass bereits nach 53 Tagen ein progredienter CT-Befund erhoben wurde.
Häufiger als FRS2-Amplifikationen sind FGFR2-Fusionen im CCA. Da FRS2 in diesem aberrant aktivierten Signalweg stromabwärts eine zentrale Rolle einnimmt, stellte sich die Frage, ob FRS2 eine potenzielle Zielstruktur für eine Therapie sein könnte. Eine gegen FRS2 gerichtete Therapie könnte nicht nur ein potenzieller Ansatz für Patienten mit FRS2-Amplifikation sein, sondern auch für Patienten mit Punktmutationen des Rezeptors, die meist nach wenigen Monaten zu einer Resistenz gegenüber FGFR-Inhibitoren führen. Es wurden Experimente an einer FGFR2-Fusion exprimierenden Zelllinie mit siRNA gegen FRS2 durchgeführt, um den Effekt eines Knockdowns von FRS2 zu untersuchen. Der Knockdown wurde auf Proteinebene mit Western Blot Analysen bestätigt. Die Proliferation im SRB-Assay konnte nach FRS2-Knockdown signifikant gehemmt werden. Die Ergebnisse sprechen FRS2 als Zielstruktur in der Behandlung von aberrant aktivierten FGFR2-Signalwegen im CCA einen potenziell hohen Stellenwert zu.
