Erkrankungsprotein der Spinozerebellären Ataxie Typ 2 (SCA2) als Biomarker - Entwicklung eines hochsensitiven Durchsatzverfahrens

Abstract

Bisher gibt es für die neurodegenerative Polyglutamin- (PolyQ-) Erkrankung Spinozerebelläre Ataxie Typ 2 (SCA2), die sich ab einer Expansion von über 32 Repeats des Nukleotidtripletts CAG im ATXN2-Gen auf Chromosom 12q23-24.1 entwickelt, keine kausale Therapiemöglichkeit. Einen möglichen Ansatz zur Behandlung stellen Antisense-Oligonukleotide dar, welche versuchen, das expandierte Erkrankungsprotein Ataxin-2 herunterzuregulieren. Zum Monitoring solcher und weiterer Forschungsansätze bietet sich das Erkrankungsprotein der SCA2, Ataxin-2, selbst als potenzieller prognostischer und therapeutischer Biomarker an. Die hier vorliegende Studie hat es sich aus diesem Grund zum Ziel gesetzt, ein Immunassay zur Quantifizierung des Proteins Ataxin-2 zu entwickeln. Das Assay beruht auf der Methode des Time-resolved fluorescence energy transfer (TRFRET), bei der jeweils zwei mit verschiedenen Fluorophoren gelabelte Antikörper an das gleiche Protein in enger räumlicher Beziehung zueinander binden, sodass ein detektierbarer Energietransfer von dem Donor- auf den Akzeptor-Antikörper ablaufen kann, welcher mit der Proteinkonzentration korreliert. Hierzu wurden jeweils zwei als Donor fungierende Ataxin-2 spezifische Antikörper (Ataxin2poly-Tb und Ataxin2mono-Tb) in Kombination mit jeweils zwei als Akzeptor fungierenden PolyQ-spezifischen Antikörpern (MW1-D2 und 1C2-D2) in unterschiedlichen Konzentrationen getestet und miteinander verglichen. Bei der Etablierung der Assay-Bedingungen zeigte der Ataxin2poly-Tb Antikörper im Vergleich zu den Signalen des Ataxin2mono-Tb Antikörpers deutlich stärkere Signale und eine bessere Diskriminierung zwischen den zur Etablierung verwendeten wildtypischen und SCA2 Knock-In Mäusegewebeproben. Die Kombination des Ataxin2poly-Tb sowohl mit dem PolyQ-spezifischen Antikörper MW1-D2 (Ataxin2poly-Tb x MW1-D2 0,3 ng/μl x 3 ng/μl) als auch mit dem 1C2-D2 (Ataxin2poly-Tb x 1C2-D2 0,3 ng/μl x 10 ng/μl) zeigte vergleichbare Ergebnisse, wobei stets beachtet werden sollte, dass der 1C2-D2 erst ab einer Glutaminanzahl von über 37Q an das Protein Ataxin-2 bindet und sich aus diesem Grund bei der Analyse zukünftiger Patientenproben von Mutationsträgern unbekannter und dementsprechend eventuell geringerer Repeat-Längen als untauglich erweisen könnte. Neben den Antikörperkombinationen und -konzentrationen zeigten sich bei der Etablierung der allgemeinen Bedingungen des TR-FRET Assays zur Detektion des expandierten Proteins Ataxin-2 der Lysepuffer RIPA, Proben mit einer Gesamtproteinkonzentration von 1 μg/μl, die Verarbeitung der Proben im gefrorenen Zustand und ein Time Delay von 50 μs als Zeitabstand zwischen Aussendung des Lichtimpulses zur Anregung der Fluorophoren und Messung des Signals als am besten geeignet. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass der hier in dieser Studie etablierte Assay spezifisch nur das expandierte Protein Ataxin-2 und nicht beispielsweise andere Proteine mit einem PolyQ-Bereich detektierte. Auch konnte unter Verwendung von SCA2 Mausmodellen mit unterschiedlich langen CAG-Repeats (42 CAG und 100 CAG) demonstriert werden, dass die Länge der CAG-Repeats nicht für das Ansprechen der Signale im TR-FRET verantwortlich ist. Für die zukünftige Verwendung des Assays zur Überwachung der Erkrankungsprogression und des Therapie-Ansprechens von Protein-Reduktionstherapien bei SCA2-Mutationsträgern ist es essenziell, dass das Assay Schwankungen in der Ataxin-2 Proteinkonzentration unterscheiden kann. In durchgeführten siRNA-Experimenten zur Herunterregulation des Proteins Ataxin-2 und in Starvation-Experimenten zur Hochregulation des Proteins Ataxin-2 konnten Proteinveränderungen zuverlässig gemessen werden. Abschließend wurden in der hier vorliegenden Studie Fibroblasten, induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) und iPSC-abgeleitete kortikale Neurone (CNs) von SCA2-Patienten mittels des neu etablierten Assays erfolgreich analysiert. Der in dieser Studie entwickelte TR-FRET Assay zur Detektion des Erkrankungsproteins der Spinozerebellären Ataxie Typ 2, Ataxin-2, eignet sich mit den hier etablierten Bedingungen optimal, um tierische oder menschliche Proben wie beispielsweise Zellkulturen- und Gewebeproben zu analysieren, in denen eine ausreichend hohe Konzentration des Proteins zu erwarten ist. Um Messungen in humanen Flüssigkeiten wie Blut oder Cerebrospinalflüssigkeit zu gewährleisten und somit das Protein Ataxin-2 als molekularen Biomarker für den klinischen Gebrauch nutzbar zu machen, kann auf Basis der in dieser Arbeit entwickelten Ergebnisse ein Wechsel auf eine ultrasensitive Methode wie das Single Molecule Counting (SMC) erfolgen.