Experimental nephrotic syndrome in mice with an inducible deletion of podocin and the role of plasminogen in sodium retention

Abstract

Die Natriumretention ist das Kennzeichen des nephrotischen Syndroms (NS) und wird wahrscheinlich durch die proteolytische Aktivierung des epithelialen Natriumkanals (ENaC) durch aberrant gefilterte Serinproteasen vermittelt. Plasmin ist die am häufigsten vorkommende Serinprotease im nephrotischen Urin von Patienten und Tierversuchsmodellen und wurde als verantwortlich für die ENaC-Aktivierung vorgeschlagen. In vivo fehlt jedoch ein Beweis für die wesentliche Rolle der ENaC-Aktivierung durch Plasmin im experimentellen NS. Daher wurde ein zuverlässiges Mausmodell benötigt, das experimentelle NS mit Plasminogenmangel entwickelt. In dieser Studie wurden Mäuse mit induzierbarem nphs2-Mangel in Kombination mit einem podozytenspezifischen TetO-Cre-Lox-P-System zur Modellierung von experimentellem NS verwendet (im folgenden nphs2Δipod-Mäuse genannt). Diese Mäuse wurden mit Mäusen mit Plasminogenmangel (Bl6-Plgtm1Jld oder plg-/-) gekreuzt, um Double-Knockout-Mäuse (nphs2Δipod*plg-/-) zu erzeugen. NS wurde nach einer oralen Doxycyclin-Behandlung für 14 Tage sowohl in nphs2Δipod*plg+/+ als auch in nphs2Δipod*plg-/- Mäusen induziert und die Mäuse sodann auf die Entwicklung einer Natriumretention und ENaC-Aktivierung untersucht. Zur Prüfung des Effekts des Serinproteaseinhibitors Aprotinin wurden Mäusen von jedem Genotyp subkutane Pellets mit verzögerter Freisetzung von Aprotinin implantiert. Podocin wurde in nphs2Δipod-Mäusen nach Doxycyclin-Behandlung vollständig aus Podozyten entfernt. Dies führte zur Ausprägung aller Merkmale eines NS bei Patienten, einschließlich massiver Proteinurie, Hypoalbuminämie, ausgeprägten Ödem und Hyperlipidämie. Nicht induzierte nphs2Δipod*plg-/- Mäuse hatten im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen eine normale Nierenfunktion und Natriumhandhabung. Nach der Induktion nahm die Proteinurie sowohl bei nphs2Δipod*plg-/- Mäusen ähnlich zu. Western Blot zeigte eine Ausscheidung von Plasminogen-Plasmin im Urin bei nphs2Δipod*plg+/+ Mäusen, die bei nphs2Δipod*plg-/- Mäusen fehlte. Nach dem Einsetzen der Proteinurie war die Amilorid-sensitive Natriurese in beiden Genotypen im Vergleich zum nicht induzierten Zustand erhöht, was auf eine ENaC-Aktivierung in beiden Genotypen von ähnlichem Ausmaß hinweist. Anschließend sank die Natriumausscheidung im Urin bei beiden Genotypen, was zu einer Zunahme des Körpergewichts und der Entwicklung von Aszites führte. Natriumretention und Ödem waren bei nephrotischen Mäusen 10 Tage nach dem Ende der Induktion in beiden Genotypen reversibel. Im weiteren verloren nephrotische nphs2Δipod*plg-/- Mäuse verloren mehr Körpergewicht als nphs2Δipod*plg+/+ Mäuse und wiesen eine kürzere Überlebenszeit auf. Die Behandlung mit dem Serinproteaseinhibitor Aprotinin verhinderte die Natriumretention nicht nur bei nphs2Δipod*plg+/+ Mäusen, sondern auch bei nphs2Δipod*plg-/- Mäusen. In dieser Arbeit wurde ein neues Mausmodell mit induzierbarem Podocin-Mangel charakterisiert, das zur Untersuchung der postnatalen nphs2-Mutation und der ENaC-Aktivierung durch Proteasurie ideal ist. Daneben ist dieses Modell auch geeignet, um chronische Nierenerkrankungen und deren Komplikationen wie Anämie zu untersuchen. Obwohl Plasminogen-Plasmin reichlich im Urin nachzuweisen war, waren nephrotischen nphs2Δipod*plg-/--Mäusen nicht vor einer ENaC-bedingten Natriumretention geschützt. Im Gegensatz dazu waren beide Genotypen durch die Behandlung mit dem Serinproteaseinhibitor Aprotinin geschützt. Diese Befunde weisen darauf hin, dass Plasmin für die ENaC-Aktivierung in experimentellen NS in vivo nicht erforderlich ist. Die Identität der essenziellen aprotinin-sensitiven Serinprotease(n) beim NS bleibt noch verborgen.

Sodium retention is the hallmark of nephrotic syndrome (NS) and is considered as a consequence of epithelial sodium channel (ENaC) activation by proteasuria in a proteolytic way. Plasmin is the most adequate serine proteases in urine from nephrotic patients and experimental animal models, and has been proposed indispensable for ENaC activation. However, evidence of the crucial role of plasmin in ENaC activation lacks in vivo. Thus a reliable mouse model developing experimental NS with plasminogen deficiency was needed. In this study, mice with conditional nphs2 deficiency were used for modeling experimental NS (nphs2Δipod mice), based on a podocyte specific deletion of podocin. These mice were crossed with mice lacking plasminogen (Bl6-Plgtm1Jld or plg-/-) to generate a double knockout mouse-model (nphs2Δipod*plg-/-). After a 14-day oral doxycycline treatment, both nphs2Δipod*plg+/+ and nphs2Δipod*plg-/- mice developed NS. Nephrotic mice were investigated for the ENaC activation and sodium retention during follow-up. Nphs2Δipod*plg+/+ and nphs2Δipod*plg-/- mice received the implantation of sustained release pellets containing aprotinin to determine if the serine protease inhibitor prevented sodium retention. Podocin was completely deleted from podocytes in nphs2Δipod mice after doxycycline treatment and recapitulated all the features of NS in patients including massive proteinuria, hypoalbuminemia, severe edema, and hyperlipidemia. Function of kidney and ENaC were not different in uninduced nphs2Δipod*plg-/- mice compared to the wild type mice. Quantitative of proteinuria was similar in both nephrotic nphs2Δipod*plg+/+ and nphs2Δipod*plg-/- mice. Western blot detected plasmin (ogen) in urine from nephrotic nphs2Δipod*plg+/+ mice which was absent in nphs2Δipod*plg-/- mice. The natriuresis response to amiloride was increased similarly in both genotypes after induction of NS compared to the uninduced state, which indicated ENaC activation. The decline of sodium excretion in both genotypes led to body weight increase and edema. Sodium retention and edema were then lost in nephrotic mice 10 days after the end of induction in both genotypes. Treatment with the serine protease inhibitor aprotinin prevented sodium retention in not only nphs2Δipod*plg mice but also in nphs2Δipod*plg-/- mice. In the long-term, and nphs2Δipod*plg-/- mice lost more body weight than nphs2Δipod*plg+/+ mice and had a shorter survival time. In conclusion, a new mouse model with inducible podocin deficiency was characterized featuring all aspects of nephrotic syndrome including sodium retention by ENaC activation. This model is ideal for studying postnatal nphs2 mutation and ENaC activation by proteasuria. Beside, this model is also sufficient for studying chronic kidney disease, and its complications, such as anemia. For the first time, this study indicated that mice lacking plasminogen were not protected from ENaC-mediated sodium retention, even though plasminogen-plasmin was highly abundant in the urine from experimental nephrotic syndrome. In contrast, treatment with serine protease inhibitor aprotinin abolished sodium retention in both genotypes. These findings highlighted that plasmin is not essential for ENaC activation in experimental NS in vivo. The essential aprotinin-sensitive serine protease(s) in NS remains to be identified.