Multiplexe serologische Assays zur Analyse der humoralen Immunantwort auf das Hepatitis C Virus Genotyp 4

Abstract

Hepatitis C ist eine durch das Hepatitis C Virus verursachte Lebererkrankung und zeigt global sehr unterschiedliche Prävalenzen. Die Verbreitung der sieben HCV Genotypen unterscheidet sich ebenfalls geografisch sehr stark. In Ägypten beträgt die Prävalenz für eine aktive HCV Infektion 10 % und die Seroprävalenz 15 % [32]. Außerdem ist Ägypten weltweit das Land mit der höchsten Prävalenz von HCV Genotyp 4 [33]. Zur Vermeidung von Folgeerkrankungen wie Zirrhosen und Hepatozellulären Karzinomen wird eine Eradikation des Virus angestrebt. Falls eine Eradikation während der akuten Infektionsphase nicht spontan erfolgt, kann eine antivirale Therapie eingeleitet werden, die inzwischen in über 90 % der Fälle erfolgreich ist [47]. Der HCV Status (akut oder chronisch) kann daher bei der Entscheidung, eine antivirale Therapie einzuleiten, eine wichtige Rolle spielen. In dieser Arbeit wurden zwei multiplexe serologische Assays zum Nachweis von anti-HCV Antikörpern der Klasse G und der Klasse M in humanen Proben entwickelt und validiert. Der multiplexe Mikrosphären-basierte serologische Assay kombiniert hierbei die Vorteile von zwei etablierten HCV Diagnostiktests: Zum einen die Durchführung des Assays im klassischen 96-Well Mikrotiterplatten Format, mit dem eine große Anzahl von Proben parallel und schnell vermessen werden können, zum anderen können mit dem Mikrosphären-basierten Assay – wie beim Line-Immunoassay – mehrere Antigene parallel im Assay verwendet werden, wodurch die Reaktivitäten gegenüber verschiedenen HCV Antigenen differenziell betrachtet werden können. Die im Rahmen dieser Arbeit entwickelten serologischen HCV Assays setzten sich aus 27, bzw. 25 verschiedenen HCV Antigenen sowie sechs internen Kontrollen zusammen und benötigten jeweils 5 µl humanes Serum oder Plasma zur Messung der IgG oder IgM Reaktivität. Mit dem anti-HCV-IgG Assay wurde ein gut charakterisierter klinischer Probensatz untersucht, der 117 Proben von Spendern mit HCV Status negativ, 166 Proben von Patienten mit HCV Status akut und 141 Proben von Patienten mit HCV Status chronisch beinhaltete. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass der anti-HCV-IgG Assay im Vergleich mit der klinischen Klassifizierung eine hohe diagnostische Spezifität (100 %) und Sensitivität (96,4 %) aufweist. Der Vergleich mit der EIA Referenzmessung zeigte eine Übereinstimmung der Spezifität und eine etwas bessere diagnostische Sensitivität im multiplexen Mikrosphären-basierten serologischen Assay als im EIA (96,4 % versus 95,2 %). Die Referenzmessung mit dem LIA bestätigte die Anwendbarkeit zur differenziellen Betrachtung von Antikörperreaktivitäten. Das entwickelte Klassifikationsverfahren zur weiteren Unterscheidung von HCV Patienten in „akut“ und „chronisch“ konnte 85,1 % der Proben ihrem HCV Status entsprechend richtig klassifizieren. Diese Art der Klassifizierung bietet die Möglichkeit die klinische HCV Diagnostik zu ergänzen. Die Ergebnisse des anti-HCV-IgM Assays hingegen ergaben, dass sich dieser Assay nicht für die Klassifizierung von HCV Patientenproben eignete. Dennoch konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass im Zusammenhang mit anderen viralen Hepatitis Infektionen eine IgM Detektion durchaus sinnvoll erscheint. Durch die gezielte Verwendung von HCV g4a Antigenen in diesen serologischen HCV Assays, wurde eine detailliertere Untersuchung der humoralen Immunantwort von Patienten mit einer HCV g4 Infektion ermöglicht. Die hierarchische Clusteranalyse der IgG Messung zeigte, dass die Immunprofile der HCV Patienten in vier verschiedene Gruppen eingeteilt werden konnten. Die stärkste Reaktivität lag hier jeweils auf der Core- und NS3-Region, Antikörper gegen Antigene der NS4- und NS5-Region traten meist erst in einer späteren Phase der Serokonversion auf. Die Analyse der Proben von Patienten mit und ohne spontane Eradikation ergab kein spezielles serologisches Immunprofil, das im Zusammenhang mit einer spontanen Eradikation von HCV steht. Bei der Untersuchung von Zeitreihen konnte zunächst festgestellt werden, dass der anti-HCV Antikörpertiter nach spontaner HCV Eradikation absinkt. Die Analyse von Zeitreihen von chronischen HCV g4 Patienten zeigte zudem, dass auch diese Immunprofile nicht statisch sind, denn es konnten auch nach längerer Zeit noch Veränderungen der humoralen Immunantwort beobachtet werden. Nicht nur die Viruslast konnte einen fluktuierenden Verlauf aufweisen, auch die Reaktivitäten gegenüber bestimmten Antigenen zeigten ein ähnliches und z. T. verzögertes Verhalten. Durch multiplexe serologische Assays ist es möglich in einem einzigen Test die Antikörperreaktivitäten auf hunderten von Antigenen zu ermitteln. Solche Tests können zur Detailcharakterisierung von Reaktivitäten gegenüber einer Vielzahl von Pathogenen dienen und haben langfristig gesehen das Potential, in der Routinediagnostik eingesetzt zu werden.

Hepatitis C is a globally spread liver disease and caused by the hepatitis C virus. The prevalence and the spread of the seven genotypes differs markedly according to the geographical region. In Egypt the prevalence is 10% and the seroprevalence 15% [32]. In addition, Egypt has the highest prevalence of HCV genotype 4 worldwide [33]. The major long-term complications of chronic hepatitis C are cirrhosis, end-stage liver disease, and hepatocellular carcinoma [25]. Eradication of the virus is aimed to prevent these future consequences of chronic hepatitis C. Some patients reach a viral clearance during the acute stage of the infection. If no spontaneous clearance occurs, a treatment of HCV is possible and is nowadays effective in > 90% of the cases [47]. Due to the possibility of spontaneous clearance, the hepatitis C status (acute or chronic) can play an important role for the decision of initiating an antiviral therapy.

In this thesis two multiplexed serological assays for the detection of anti-HCV antibodies of the classes IgG and IgM in human samples were generated and validated. The multiplex microsphere-based serological HCV assay combines the advantages of two commercially available diagnostic tests for hepatitis C. On the one hand, the classical 96-well microtiter plate format of an enzyme immunoassay was used, whereby a huge number of samples can be rapidly measured in parallel. On the other hand, multiple antigens – as in the line immunoassay – were used in the microsphere-based assay, thus the reactivity profile towards several antigens could be investigated. The serological assays in this thesis were developed using 27 (IgG assay) and 25 (IgM assay) different HCV antigens as well as six internal controls and the assays required each 5 µl of human serum or plasma to measure IgG or IgM reactivity.

A well characterized clinical sample set, consisting of 117 samples from HCV negative donors, 166 samples from acutely infected HCV patients and 141 samples from chronically infected HCV patients, was analysed with the anti-HCV-IgG assay. The data in this thesis demonstrated that the developed anti-HCV-IgG assay possesses a high diagnostic specificity (100%) and sensitivity (96.4%). The comparison with an EIA reference measurement showed that the specificity was in accordance and the diagnostic sensitivity was a little bit better with the developed multiplex microsphere-based anti-HCV-IgG assay (96.4% versus 95.2%). The reference measurement with the LIA confirmed the applicability for considering the reactivity towards several antigens differentially in one measurement. The developed classification method for discrimination of acutely and chronically infected HCV patients could correctly classify 85.1% of the samples and thus offers the possibility to supplement the clinical HCV diagnostics.

The results of the anti-HCV-IgM measurement showed that this assay is not suitable for the classification of HCV patients. Nevertheless, it could be demonstrated that an IgM detection would be reasonable in the context of other viral hepatitis infections.

The usage of HCV g4a antigens in these serological HCV assays allowed a more detailed investigation of the humoral immune response of patients with a HCV g4 infection. The hierarchical cluster analysis showed four distinct groups of HCV immune profiles, in which the strongest IgG responses were observed on the Core and NS3 antigens and antibodies towards NS4 and NS5 antigens arose in a later stage of seroconversion. The analysis of patient samples with and without spontaneous viral clearance did not yield a special serological immune profile, which is associated with spontaneous clearance of HCV. In the study of the time courses a drop of anti-HCV antibodies could be detected after spontaneous viral clearance. The analysis of time courses from chronically infected HCV g4 patients illustrated that also these immune profiles are not static and even after a longer time period changes of the humoral immune response could be detected. Not just the viral load showed a fluctuating progression, also the reactivity towards some antigens bore resemblance to this behavior.

With multiplex serological assays it is possible to determine antibody reactivity towards hundreds of antigens in a single test. Such assays are great tools for epidemiological studies and can be used for in-depth characterization of reactivity towards multiple pathogens. Furthermore, they have the long-term potential to be applied in routine diagnostics.