Translations-Reinitiation bei Caliciviren - Struktur-/Funktionsbeziehungen im relevanten RNA Motiv

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URI: http://hdl.handle.net/10900/56984
http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-dspace-569840
Dokumentart: PhDThesis
Date: 2014-10-16
Language: German
Faculty: 7 Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Department: Biochemie
Advisor: Meyers, Gregor (Prof.Dr.)
Day of Oral Examination: 2014-09-19
DDC Classifikation: 500 - Natural sciences and mathematics
570 - Life sciences; biology
Keywords: Caliciviren , Rabbit hemorrhagic disease virus
Other Keywords: Translation
Termination-Reinitiation
RNA-Sekundärstruktur
License: http://tobias-lib.uni-tuebingen.de/doku/lic_mit_pod.php?la=de http://tobias-lib.uni-tuebingen.de/doku/lic_mit_pod.php?la=en
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Inhaltszusammenfassung:

Die Familie der Caliciviridae umfasst eine Reihe tier- und humanpathogener Krankheitserreger. Die Virionen sind nicht umhüllt und das virale Genom besteht aus einzelsträngiger RNA positiver Polarität. Die Expression des minoren Capsidprotein VP2 erfolgt über einen ungewöhnlichen Weg. VP2 wird zumindest hauptsächlich von einer subgenomischen RNA (sg mRNA) exprimiert, die kollinear mit dem 3‘ Drittel der genomischen RNA ist. Diese sg mRNA enthält zwei getrennte offene Leseraster (ORF) und ist besonders, weil sie damit bicistronisch ist, während in eukaryotischen Zellen mRNAs monocystronisch sind. Das offene Leseraster, das für VP2 kodiert, liegt im 3‘ Bereich der RNA. Eukaryotische Zellen sind im Normalfall nicht in der Lage, einen solchen 3‘ ORF zu exprimieren, denn die Translationsinitiation erfolgt hier aus mechanistischen Gründen in der Regel nahe am 5‘ Ende, meist am 1. AUG. Die Translation des 5‘ terminal gelegenen ORF der Caliciviren wird über ein Protein namens VPg initiiert. Dieses Protein ersetzt funktionell das bei eukaryotischen mRNAs vorhandene 5‘ Cap, das für die Assemblierung des Initiationskomplexes wichtig ist. In der sgmRNA kodiert der 5’seitige ORF für das Hauptcapsidprotein VP1. Der 3‘ ORF der sgmRNA kann nur exprimiert werden, nachdem der 5‘ gelegene ORF bis zum regulären Ende translatiert wurde. Die Expression des VP2 läuft also über eine Termination-Reinitation ab. Das RNA-Element, das diese Termination-Reinitiation ermöglicht, wird als Termination Upstream Ribosome Binding Site (TURBS) bezeichnet. In der vorliegenden Arbeit wurde die TURBS des Rabbit Haemorrhagic Diesease Virus (RHDV) weitergehend charakterisiert. Der Fokus lag auf der Sekundärstrukturanalyse dieses RNA-Elements. Dazu wurde die in der Literatur beschriebene minimale TURBS-Region mit je ca. 30 Basen 3‘ und 5‘ flankierender Sequenzen mit einem SP6 RNA-Polymerasepromotor fusioniert, diese Promotor-Sequenzkombination beidseitig mit EcoRV-Schnittstellen versehen und in ein Vektorrückgrat kloniert, welches die Vermehrung in Baktierienzellen ermöglichte. Durch Spaltung mit EcoRV konnte die DNA gewonnen werden, welche als Vorlage für die in-vitro Transkription definierter RNAs diente. Diese RNAs wurden in Puffermedien, die die Ausbildung von RNA-Strukturen ermöglichten, einer partiellen Nukleasespaltung bzw. partieller Spaltung/Modifikation mit Chemikalien unterzogen. Die Produkte dieser Reaktionen konnten über direkte 5‘ ³²P Markierung der untersuchten RNAs bzw. indirekte Markierung über cDNA Synthese mit 5‘ ³²P markierten Primern detektiert werden, nachdem sie ihrer Größe entsprechend in denaturierenden Polyacrylamid-Gelen aufgetrennt worden waren. Nach der Identifizierung der gepaarten und ungepaarten Basen der TURBS mit diesem System wurde ein Arbeitsmodell der Sekundärstruktur erstellt. Dieses Modell wurde anschließend durch Herstellen und Analyse von Substitionsvarianten der TURBS weiter untersucht. Dabei kamen Substitutionen zum Einsatz, welche die Ausbildung der potentiellen Basenpaare verhindern sollten. Die Varianten mit den genannten Substitutionen wurden anschließend sowohl in transienten Expressionssystemen in Zellkultur auf ihre VP2-Expressionsrate als auch im Strukturaufklärungssystem auf Sekundär-strukturänderungen untersucht. Der nächste Schritt war die Einführung von zu den ersten Substitutionen reziproke Austausche, welche ebenfalls in Expressions- und Strukturaufklärungssystem auf Komplementation der primären Austausche getestet wurden. Mit diesem System konnte eine der neu gefundenen Interaktionen bestätigt werden. Bei einer zweiten konnten nur Hinweise auf die Interaktion gefunden werden, weil Änderungen auf einer Seite des vorgeschlagenen Duplex die TURBS Gesamtstruktur beeinträchtigten. Bei einer dritten Region waren die Einflüsse zu schwach, um grundsätzliche Aussagen zu treffen. Aus der Kombination der Daten für die Wildtyp-TURBS und denen für die der verschiedenen Varianten wurden synthetische Minimal-TURBS Konstrukte erstellt, bei denen nur die essentiellen Strukturen unverändert gelassen wurden. Diese wurden ebenfalls strukturell und funktionell charakterisiert. Dabei zeigte sich, dass die gefundenen Sekundärstrukturelemente zusammen mit einem bekannten Primärsequenzmotiv und der Start/Stopp-Sequenz ausreichten, um die Reinitiation zu ermöglichen. Ausgehend von diesen Ergebnissen wurde ein Modell der Sekundärstruktur der RHDV-TURBS sowie ein hypothetisches Modell für die TURBS-Funktion erstellt.

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