Analysis of the post-transcriptional regulatory role of aconitase from Streptomyces viridochromogenes Tü494

Abstract

Aconitasen gehören zu den wichtigsten Enzymen der zentralen Stoffwechselwege in Citrat- und Glyoxylat-Zyklus und katalysieren hier die Isomerisierung von Citrat zu Isocitrat über cis-Aconitat. Zusätzlich zu ihrer katalytischen Funktion besitzen Aconitasen in einigen Fällen auch eine regulatorische Funktion. Unter Eisenmangelbedingungen oder oxidativem Stress verliert das [4Fe-4S]- Cluster ein Fe2+-Ion und Aconitase somit auch ihre katalytische Funktion. In diesem Zustand ist die Aconitase regulatorisch aktiv und kann als Iron Regulatory Protein (IRP) an sogenannte Iron Responsive Elements (IREs), die auf mRNAs lokalisiert sind, binden und deren Expression posttranskriptional regulieren. In dieser Arbeit wurde die Aconitase aus S. viridochromogenes Tü494 (AcnA) untersucht, weil man davon ausging, dass es eine Verknüpfung zwischen primären- und sekundären Metabolismus herstellen kann. Die S. viridochromogenes Aconitase-Mutante (MacnA) hat einen Differenzierungsdefekt, der durch das Ausbleiben von Sporulation, Luftmycelbildung und fehlende Antibiotikaproduktion gekennzeichnet ist. Diese Mutante ist außerdem empfindlich gegenüber oxidativem Stress und Hitzestress. Mit Hilfe von in silico Analysen konnten konservierte IRE-Motive in S. viridochromogenes-Genom identifiziert und deren Funktionalität in RNAGelshift- Experimenten mit aufgereinigter Aconitase verifiziert werden. Außerdem wurde erstmalig durch Immunoblot-Experimente gezeigt, dass AcnA die Menge des RecA Proteins, die erforderlich ist um DNA-Schäden unter oxidativem Stress zu reparieren, regulatorisch beeinflusst. Diese Ergebnisse wurden zusätzlich durch RT-PCR-Experimente bestätigt. Vergleichende Proteom-Analysen lieferten neuartige in vivo Beweise für eine regulatorische Funktion der Aconitase in S. viridochromogenes unter oxidativem Stress.

Aconitases are one of the major enzymes in tricarboxylic acid and glyoxylate cycles but in some cases also can act as regulators on post-transcriptional level. As enzymes they catalyze the interconversion of citrate to isocitrate via cis-aconitate. However, under conditions of iron starvation or oxidative stress the [4Fe-4S] cluster is disassembled and aconitases function as posttranscriptional regulators that bind specific mRNA secondary structures known as iron responsive elements (IREs). In this study the aconitase from S. viridochromogenes Tü494 (AcnA) was analyzed, since it was assumed that this protein may constitute a linkage between primary and secondary metabolism. The S. viridochromogenes aconitase mutant (MacnA) is unable to develop aerial mycelium, to sporulate or to produce antibiotic. This mutant is also highly sensitive to oxidative stress and higher temperatures. In silico analysis of the S. viridochromogenes genome revealed the presence of several conserved IRE-like structures. In this study, their functionality was validated in electrophoretic mobility shift experiments. It could be shown that AcnA from S. viridochromogenes is an RNA binding protein and exhibits regulatory function on post-transcriptional level. Furthermore, the previously suggested AcnA-mediated regulation of the synthesis of recombinase A (RecA), which is required to repair DNA damage under oxidative stress, was confirmed. It was shown that the recA transcript is more stabile under oxidative stress in the WT than in MacnA. The proteomic approach provided new in vivo evidence for AcnA-mediated regulation under oxidative stress conditions and allowed to identify proteins, of which the expression may be associated with the impaired defense of MacnA against free radicals.