Target-Fishing entzündungsrelevanter Arzneistoffe sowie biochemisch- molekularpharmakologische Charakterisierung der Arzneistoff-Target Interaktion

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dc.contributor.advisor Werz, Oliver (Prof. Dr.) de_DE
dc.contributor.author Behnke, Felix de_DE
dc.date.accessioned 2011-06-24 de_DE
dc.date.accessioned 2014-03-18T10:22:57Z
dc.date.available 2011-06-24 de_DE
dc.date.available 2014-03-18T10:22:57Z
dc.date.issued 2011 de_DE
dc.identifier.other 346649943 de_DE
dc.identifier.uri http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-opus-56912 de_DE
dc.identifier.uri http://hdl.handle.net/10900/49541
dc.description.abstract Der Pull-down Assay ist ein nützliches Werkzeug für die Identifizierung und Evaluierung von Arzneistoff Zielstrukturen. In sogenannten “Target-Fishing” Experimenten wird ein Arzneistoff oder eine pharmakologisch aktive Substanz kovalent an eine unlösliche Matrix gebunden und mit einen Zelllysat als Proteinquelle inkubiert. Proteine, die hierbei an den Arzneistoff binden, können isoliert und identifiziert werden. Diese Arbeit beschreibt grundlegende Verbesserungen sowie die beispielhafte Anwendung zur Identifizierung von Zielstrukturen für bislang uncharakterisierte, anti-entzündliche Wirkungen ausgewählter Substanzen. Im methodischen Teil dieser Arbeit werden (i) grundlegende Verbesserungen experimenteller Bedingungen, (ii) innovative Strategien der Liganden Immobilisation, (iii) die Entwicklung eines biokompatiblen, UV Licht spaltbaren Linker-Systems, (iv) die Etablierung einer semi-quantitativen Fishing-Methode zur Unterscheidung zwischen selektiv und unselektiv gebundenen Targets sowie (v) die Etablierung der zweidimensionalen-differential Gelelektrophorese für die Analyse von Target-Fishing Eluaten, dargestellt. Für die Verbesserung grundlegender, experimenteller Bedingungen des Target-Fishings wurde der Einfluss verschiedener Puffer-Systeme, Matrixmodifikationen und Methoden zur Herstellung von Zelllysaten untersucht. Es wurden neuartige Strategien zur Immobilisierung pharmakologisch aktiver Substanzen entwickelt. So konnten Liganden über Monoxim-Funktionen an Epoxy-aktivierte Matrices gebunden werden. Des Weiteren wurde ein Verfahren zur Herstellung Carboxymethoxylamin aktivierter Oberflächen für die Immobilisierung von Liganden über carbonyl Funktionen entwickelt. Da die Inkubation von Matrix gebundenen Liganden sowohl zu spezifischen als auch zu unspezifischen Protein-Liganden Interaktionen führt, wurden Methoden entwickelt, um zwischen spezifischen und unspezifischen Interaktionen zu unterscheiden oder Probleme hinsichtlich unspezifisch gebundene Proteine generell zu umgehen. So wurden eine semi-quantitative fishing Methode und neuartige Verknüpfungsstrategien etabliert. Wir konnten ein biokompatibles, Tageslicht stabiles UV Licht spaltbares Linker-System entwickeln, das eine Abspaltung des Liganden-gebundenen Targets durch Bestrahlung mit UV Licht ermöglicht. Die Funktionalität dieses Linker-Systems wurde anhand der bekannten Testosteron- Androgenrezeptor Interaktion unter Beweis gestellt. Um zusätzlich die Analytik gefischter Proteine zu optimieren, wurde die 2D-DIGE Methode etabliert und an die Anforderungen des Target-Fishings angepasst. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Serinproteasen Proteinase 3 (PR3) und Cathepsin G (CG) als Bindungspartner für Betulinsäure identifiziert. Es konnte gezeigt werden, dass Betulinsäure die Aktivität der PR3 mit einem IC50 Wert von 30 µM inhibieren konnte, während die Aktivität von CG nicht beeinflusst wurde. Damit kann BA als selektiver Inhibitor der PR3 gesehen werden. Mit der Verwendung von Resveratrol (RV) als Ligand für target-fishing Experimente konnte das KH-domain splicing regulatory protein (KHSRP) als Bindungspartner für RV identifiziert werden. Dies bietet einen neuartiger Ansatzpunkt für die Erklärung bekannter in vivo Effekte des Resveratrols. Des weiteren wurden die Steroidhormone Testosteron und Progesteron für target-fishing Experimente verwendet, um die physiologischen, nichtgenomischen und anti-inflammatorischen Effekte dieser Substanzen zu untersuchen. Hierbei konnten die Proteine Vimentin, Serin Protease Inhibitor B1, Visfatin (Vis) und Heatshock protein 27 (HSP27) als Bindungspartner dieser Steroidhormone identifiziert werden. In weiteren Experimenten konnte gezeigt werden, dass Vis direkt und selekiv an Testosteron bindet. Wir konnten des Weiteren zeigen, dass Testosteron die ERK aktivierenden Eigenschaften des Vis verstärkt und damit neue Erkenntnisse über die geschlechtsspezifische, basale Regulation der ERK Phosphorylierung erbracht hat. HSP27 wurde sowohl als Bindungspartner für Testosteron als auch für Progesteron identifiziert. Es konnte gezeigt werden, dass die Bindungsaffinität beider Steroide vom Phosphorylierungsstatus des HSP27 abhängt und Testosteron eine höhere Affinität zu unphosphoryliertem HSP27 hat, während Progesteron bevorzugt an die phosphorylierte Form bindet. de_DE
dc.description.abstract Pull-down assays are suitable and valuable tools to evaluate drug-target interactions as well as a vast variety of other ligand protein interactions. In so-called target-fishing experiments a drug, covalently bound to an insoluble matrix, is incubated with a cell lysate as source of target proteins. Thus, drug bound proteins can be isolated and identified by appropriate protein analytics. This work describes essential methodical improvements as well as the exemplary application of this method to identify targets for selected active compounds with so far uncharacterised anti-inflammatory properties. The methodological part of this work we could achieve: (i) essential improvements of conditions for the target-fishing approach, (ii) innovative strategies for ligand immobilisation, (iii) the development of a biocompatible UV light cleavable linker system, (iv) the development of a semiquantitative fishing approach for determination of selective and unselective bound proteins as well as (v) the development of 2D-difference gelelectrophoresis for analysis of target-fishing eluates. To improve general fishing conditions the influence of selected buffer systems, elution conditions, matrix modifying procedures and the preparation of cell lysates as source of target proteins was extensively evaluated. For the generation of novel fishing constructs, new immobilisation strategies had to be found. Thus, the immobilisation of compounds over non-reactive monoxime residues could be achieved. Furthermore, a novel method for immobilisation of ligands over keto- and aldehyde residues could successfully be developed. For this purpose a procedure for the production of carboxymethoxylamine activated matrices was established. Since incubation of matrix-coupled ligands with proteins leads to both: specific protein-ligand interactions as well as unspecific protein-matrix interactions, we developed techniques that either allow the differentiation between selective and unselective bound proteins or essentially bypasses problems related to unspecific protein-matrix interactions. Thus, a semi-quantitative target-fishing approach as well as novel linker strategies were established. We designed a biocompatible, daylight stable UV light reactive linker system which allows us to cleave off immobilised ligands together with the bound protein(s) simply by UV light exposure. This linker system is based on an o-nitrobenzylic core that can be cleaved via norrish type II reaction. Using the known testosterone-androgen receptor interaction we could show that the use of this cleavable linker system results particularly in the elution of specific bound proteins. To advance the analytics of fished proteins, the 2D-DIGE approach was established and modified to the requirements of the target-fishing approach. In the course of this study the serine proteases proteinase 3 (PR3) and Cathepsin G (CG) were identified as binding partner of betulinic acid (BA). BA was shown to inhibit the enzymatic activity of PR3 with an IC50 value of 30 µM, whereas the activity of GC was not affected at all. Thus, BA can be seen as a selective PR3 inhibitor. The use of a resveratrol (RV) derivative for target-fishing experiments resulted in the identification of the KH-domain splicing regulatory protein (KHSRP) as binding partner. The interaction of RV with KHSRP could be the starting point for the explanation of known in vivo effects of RV. The steroid hormones testosterone and progesterone were used for target-fishing experiments in order to investigate non-genomic effects and the molecular reason for their influence in inflammatory diseases. The proteins Vimentin, Serin protease B1, Visfatin (Vis) and Heatshock protein 27 (HSP27) were identified as binding partners of steroid hormones. In more detailed experiments Vis was found to bind directly and selectively to testosterone. Furthermore, it could be shown, that testosterone amplifies the ERK activating properties of Vis, which gives new insights in the gender specific regulation of basal ERK phosphorylation levels. HSP27 was identified as binding partner for both: testosterone and progesterone. It could be shown, that the binding affinity of both steroids to HSP27 depends on the phosphorylation state of HSP27. These findings could explain a stronger interaction between HSP27 and testosterone to compensate the lower HSP27 levels in male platelets. en
dc.language.iso de de_DE
dc.publisher Universität Tübingen de_DE
dc.rights ubt-podok de_DE
dc.rights.uri http://tobias-lib.uni-tuebingen.de/doku/lic_mit_pod.php?la=de de_DE
dc.rights.uri http://tobias-lib.uni-tuebingen.de/doku/lic_mit_pod.php?la=en en
dc.subject.classification Arzneimittelforschung , Entzündung , Testosteron , Resveratrol , Paracetamol , Differentielle Gelelektrophorese , Norrish-Reaktion , Immobilisation de_DE
dc.subject.ddc 500 de_DE
dc.subject.other Betulinsäure , Target-Fishing de_DE
dc.subject.other Target-fishing , Drug target research , Inflammation , Androgen , Testosterone , Pull-down assay , Drug target discovery en
dc.title Target-Fishing entzündungsrelevanter Arzneistoffe sowie biochemisch- molekularpharmakologische Charakterisierung der Arzneistoff-Target Interaktion de_DE
dc.title Target-fishing of drugs relevant to inflammation and biochemical molecular pharmacological characterisation of the drug-target interaction en
dc.type PhDThesis de_DE
dc.date.updated 2011-06-30 de_DE
dcterms.dateAccepted 2011-04-28 de_DE
utue.publikation.fachbereich Pharmazie de_DE
utue.publikation.fakultaet 7 Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät de_DE
dcterms.DCMIType Text de_DE
utue.publikation.typ doctoralThesis de_DE
utue.opus.id 5691 de_DE
thesis.grantor 7 Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät de_DE

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