Untersuchungen zur Bedeutung endosomal/lysosomaler Proteasen in subzellulären Kompartimenten antigenpräsentierender Zellen

Abstract

Ein Schwerpunkt dieser Arbeit war die subzelluläre Fraktionierung verschiedener antigenpräsentierender Zellen mit Hilfe von differentieller Zentrifugation, Percolldichtegradienten-Zentrifugation und trägerfreier Elektrophorese. Die Kombination dieser Methoden erlaubt eine Auftrennung in verschiedene endosomal/lysosomale Kompartimente, die mit fluorogenen Substraten, Immunoblot, ELISA und HPLC charakterisiert wurden. In isolierten Zellkompartimenten von Keratinozyten wurden die Aktivitäten der Cathepsine B, L und S bestimmt, wobei beachtliche Aktivitätsunterschiede zwischen HaCaT-und primären Keratinozyten im Vergleich zu syngenen B-Zellen gemessen wurden. Eine Interferon- Stimulation führte bei den Keratinozyten zur Expression von MHC Klasse II-Molekülen, invarianter Kette und einer gesteigerten Cathepsin S-Aktivität. Auf RNA-Ebene ergab sich eine starke Cathepsin S-Induktion im Vergleich zur Kontrolle. Auf Proteinebene konnte dies bestätigt werden. Von mit Interferon- stimulierten HaCaT-Keratinozyten wurden MHC Klasse I- und II- präsentierte Peptide isoliert und mit Hilfe der Massenspektrometrie konnten 15 Peptide identifiziert werden. Als weiterer Schwerpunkt wurde die Asparaginylendopeptidase (AEP) durch Spaltexperimente mit 20 Hexapeptiden, mit jeweils allen 20 natürlichen Aminosäuren in P1`Position, untersucht. Die Analyse mit HPLC und einem Kompetitionsassay ergab die Spaltbarkeit aller Peptide. Mit Ausnahme des langsam umgesetzen Peptides mit Prolin in P1`Position fungierten alle anderen als gute Substrate für AEP. Daraus folgt, das für die hochspezifische Spaltung mit AEP Asparagin an der P1 Position unabdingbar ist, während die P1`Position mit allen 20 Aminosäuren besetzt sein kann. Aus Verdauexperimenten mit Myoglobin und dem Myelin-basischen-Protein, die jeweils zwei potentielle AEP-Spaltstellen enthalten, konnten keine weiteren Erkenntnise über die Spaltmotive gewonnen werden.

A major topic of this work was the subcellular fractionation of different antigen presenting cells using differential centrifugation, percoll density gradient centrifugation and free flow electrophoresis. The combination of these methods allows the separation of different endosomal/lysosomal compartments, which were characterized by fluorogenic substrates, immunoblot, ELISA and HPLC. Cathepsin B, L and S activities were measured in isolated cell compartments of keratinocytes, with considerable differences between HaCaT-keratinocytes, keratinocytes in primary culture and syngenic B cells. Stimulation with interferon- resulted in the expression of MHC class II molecules and invariant chain, as well as in increased cathepsin S activity. On the mRNA level, cathepsin S was strongly induced in comparison to the control. This also was confirmed on the protein level. MHC class I and II presented peptides were isolated from interferon- stimulated HaCaT-keratinocytes, and 15 peptides have been identified by mass spectrometry. A further focus was the investigation of asparaginyl endopeptidase (AEP) by cleavage experiments of 20 hexapeptides, designed in such a way that all natural 20 amino acids occur at the P1`position of one of the different peptides. The analysis by HPLC and a competition assay demonstrated cleavage of all peptides. With the exception of the peptide with proline at the P1`position with a slow turnover all peptides are good substrates for AEP. This means that AEP is restricted towards aspargine at the P1 position, whereas the P1`position can be covered by all 20 amino acids. Both myoglobin and myelin basic protein, containing two potential AEP cleavage sites each, revealed no detailed information about cleavage motives in digestion experiments.