Untersuchungen zur Funktion von Heparansulfat-Proteoglykanen während der Invasion von Neisseria gonorrhoeae in Epithelzellen

Abstract

Neisseria gonorrhoeae (Ngo) adhäriert über das Opa50-Protein an nicht-polarisierte Epithelzellen. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob die Adhärenz des Opa50-Proteins an Heparansulfat-Proteoglykane (HSPG) ausreicht, um eine Invasion von Ngo zu bewirken. Durch Kopplung von Latexbeads mit einem Antikörper gegen Heparansulfat-Glukosaminoglykane konnte über Immunfluoreszenzfärbungen nachgewiesen werden, daß die Beads von den Zellen aufgenommen werden. Die Phagozytose erfolgt mit der gleichen Kinetik wie die von Ngo. Für die Phagozytose der Beads ist eine Kreuzvernetzung der HSPGs sowie ein intaktes Zytoskelett. Die phagozytische Aufnahme der Beads wird durch Inhibitoren der Protein Kinase C (PKC) gehemmt und die Invasion der Beads wird durch die Zugabe von Vitronektin bzw. Serum gesteigert wie es für Ngo gezeigt wurde. Diese Daten weisen darauf hin, daß eine Kreuzvernetzung der HSPGs zu einer Phagozytose führen kann und daß das etablierte System ein gutes Modell für die Aufnahme von Ngo darstellt. Des weiteren führt die Überexpression von Syndekan-1 und Syndekan-4 in HeLa Zellen zu einer erhöhten Invasion von Ngo in diesen Zellinien. Deletionen der intrazellulären Domäne bewirken einen annähernd vollständigen Rückgang der Phagozytose von Ngo, was darauf hinweist, daß die intrazelluläre Domäne für die Signaltransduktion von Bedeutung ist. Weitere Mutationen in der intrazellulären Domäne von Syndekan-4, die das Dimerisierungsmotiv beeinflussen, das die Bindungsstelle für die PKC bzw. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat darstellt, führen ebenfalls zu einem Rückgang der Invasion von Ngo. Das gleiche gilt für die Deletion des C-terminalen EFYA Motifs, das für die Bindung von Syntenin oder CASK verantwortlich ist. Syndekan-1 und Syndekan-4 bewirken also die phagozytische Aufnahme von Ngo in Epithelzellen und die intrazellulären Domänen spielen eine wichtige Rolle bei der Signaltransduktion oder der Verankerung am Zytoskelett der Zelle.

Neisseria gonorrhoeae (Ngo) expressing the outer membrane protein Opa50 can adhere to epithelial cells via binding to heparan sulphate proteoglycan (HSPG) receptors. This study investigated if adherence of gonococci to HSPGs is sufficient for phagocytosis. Coating of latexbeads with an antibody against heparansulfate-glucosaminoglycans leads to phagocytic uptake into epithelial cells as shown by immunofluorescence staining. The phagocytosis of the beads has the same kinetic as uptake of gonococci inot epithelial cells. The phagocytic uptake of beads requires crosslinking of HSPGs and an intact cytoskeletton as described for Ngo. The uptake process can be inhibited by protein kinase C inhibitors and the invasion is stimulated by the serum or the serum factor vitronectin. This data lead to the conclusion that crosslinking of HSPGs leads to phagycytosis and that the established system is a good model for uptake of gonococci. Overexpression of syndecan-1 and syndecan-4 in HeLa cells leads to an increase in Ngo invasion in this cell lines. In contrast, transfection with syndecan-1 and syndecan-4 mutant constructs lacking the intracellular domain results in an abrogation of the invasion process, characteristic of a dominant negative mode of action. A concomitant loss in the capacity to mediate Ngo uptake was also observed with syndecan-4 mutant constructs carrying lesions in the dimerisation motif necessary for the binding of protein kinase C (PKC) and phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) and mutants which are deficient in a C-terminal EFYA amino acid motif responsible for binding to syntenin or CASK. Therefore syndecan-1 and syndecan-4 can both mediate Ngo uptake into epithelial cells, and their intracellular domains play a crucial role in this process perhaps by mediating signal transduction or anchorage to the cytoskeleton.