Untersuchung von zwei verwaisten RiPP-Biosynthese-Genclustern aus Chitinophaga dinghuensis und Ohtaekwangia koreensis

Abstract

Ribosomally synthesized and posttranslationally modified peptides (RiPPs) represent a structurally diverse group of microbial natural products. Due to their potential antibiotic, antiviral, antifungal, or analgesic effects, there is great interest in the identification of new RiPPs. Particularly promising in this regard are so-called orphaned biosynthetic gene clusters (BGCs), whose natural product is still unknown. The aim of this work was the experimental investigation of two orphaned RiPP BGCs from Chitinophaga dinghuensis (chd cluster) and Ohtaekwangia koreensis (ohk cluster). Both clusters were first analyzed bioinformatically and annotated using BLAST. Supplementary structure predictions provided only limited additional insights. This suggests that the maturases under investigation are functionally specialized or enzymes that have not yet been sufficiently characterized. In the chd cluster, the focus was on the functional analysis of the predicted maturases. In addition to the previously described peptide arginase ChdR, the putative lanthionine dehydratase ChdB and the two lanthionine cyclases ChdC1 and ChdC2 were investigated. ChdR catalyzes the conversion of peptidically bound arginines to ornithine, while ChdB, in combination with ChdC1 and ChdC2, presumably forms two ring structures. For the ohk cluster, the central focus was on the biochemical characterization of the peptide arginase OhkR from O. koreensis. Through heterologous (co-)expression, the arginase activity of OhkR was clearly confirmed in vivo and in vitro. The localization of the modifications and the determination of the reaction directionality revealed unusual C-to N-terminal processing. Kinetic analyses showed high substrate affinity with simultaneously low turnover rate. Furthermore, OhkR exhibited substrate tolerance toward non-native precursor peptides from a related BGC. Structural predictions and mutation analyses provided clues to sequence motifs that could be relevant for substrate recognition. Co-expressions were also performed with the other maturases of the ohk cluster, but no activity could be detected in these cases. Overall, this work provides new experimental insights into the enzymatic complexity of RiPP BGCs and contributes to the characterization of different maturases. The results establish a starting point for further analysis of both clusters and for the potential identification of the corresponding natural products.

Die Dissertation ist gesperrt bis zum 24. Juli 2028 !

Ribosomal synthetisierte und posttranslational modifizierte Peptide (RiPPs) stellen eine strukturell diverse Gruppe mikrobieller Naturstoffe dar. Aufgrund ihrer potenziellen antibiotischen, antiviralen, antimykotischen oder analgetischen Wirkungen besteht großes Interesse an der Identifizierung neuer RiPPs. Besonders vielversprechend sind dabei sogenannte verwaiste Biosynthese Gencluster (BGC), deren Naturstoff noch unbekannt ist. Ziel dieser Arbeit war die experimentelle Untersuchung zweier verwaister RiPP BGC aus Chitinophaga dinghuensis (chd‑Cluster) und Ohtaekwangia koreensis (ohk‑Cluster). Beide Cluster wurden zunächst bioinformatisch analysiert und mittels BLAST annotiert. Ergänzende Strukturvorhersagen lieferten trotz hoher Modellqualität nur begrenzte zusätzliche Erkenntnisse. Dies deutet darauf hin, dass es sich bei den untersuchten Maturasen um funktionell spezialisierte oder bislang unzureichend charakterisierte Enzyme handelt. Im chd Cluster lag der Fokus auf der funktionellen Analyse der vorhergesagten Maturasen. Neben der bereits beschriebenen Peptid Arginase ChdR wurden insbesondere die putative Lanthionin Dehydratase ChdB sowie die beiden Lanthionin Zyklasen ChdC1 und ChdC2 untersucht. ChdR katalysiert die Umwandlung peptidisch gebundener Arginine zu Ornithin, während ChdB in Kombination mit ChdC1 und ChdC2 vermutlich zwei Ringstrukturen bildet. Für das ohk Cluster lag der zentrale Schwerpunkt auf der biochemischen Charakterisierung der Peptid Arginase OhkR aus O. koreensis. Durch heterologe (Ko-)Expression konnte die Arginase‑Aktivität von OhkR eindeutig in vivo und in vitro bestätigt werden. Die Lokalisierung der Modifikationen sowie die Bestimmung der Reaktionsdirektionalität zeigten eine ungewöhnliche C‑ zu N‑terminale Prozessierung. Kinetische Analysen zeigten eine hohe Substrataffinität bei gleichzeitig niedriger Umsatzzahl. Darüber hinaus zeigte OhkR eine Substrattoleranz gegenüber nicht‑nativen Präkursor Peptiden aus einem verwandten BGC. Strukturvorhersagen und Mutationsanalysen lieferten Hinweise auf Sequenzmotive, die für die Substraterkennung relevant sein könnten. Mit den anderen Maturasen des ohk Clusters wurden ebenfalls Koexpressionen durchgeführt, hier konnten jedoch keine Aktivitäten nachgewiesen werden. Insgesamt liefert diese Arbeit neue experimentelle Einblicke in die enzymatische Vielfalt der RiPP‑Biosynthese und trägt zur funktionellen Charakterisierung ungewöhnlicher Maturasen bei. Die Ergebnisse schaffen eine Grundlage für weiterführende Untersuchungen der zugehörigen Biosynthesewege und für die zukünftige Aufklärung der zugehörigen Naturstoffe.