Expanding the Molecular Toolbox for the Exploration of Natural Products from non-model Ascomycetes

Abstract

Die Dissertation ist gesperrt bis zum 27. Oktober 2027 !

Der endophytische Pilz Cyanodermella asteris DSM100826 aus der Klasse der Lecanoromycetes (Ostropales) und der marine Pilz Asteromyces cruciatus 763 aus der Klasse der Dothideomycetes (Pleosporales) stellen zwei phylogenetisch unterschiedliche Nicht-Modellorganismen dar. Bisher wurden lediglich verschiedene fermentative Strategien zur Untersuchung ihres Biosynthesepotenzials eingesetzt, wobei die Genomsequenzierung mit anschließendem „Genome Mining“ für beide Pilze eine beträchtliche Anzahl potenzieller biosynthetischer Gencluster ergab, die nur minimale bis gar keine Ähnlichkeit mit bekannten Pilzgenclustern aufweisen. Dies deutet darauf hin, dass beide Pilze zur Biosynthese weitgehend einzigartiger, noch nicht identifizierter Naturstoffe, befähigt sein könnten. Allerdings werden diese unbekannten Verbindungen mit mutmaßlicher medizinisch bzw. pharmazeutischer Anwendung unter Laborbedingungen gar nicht oder nur in unzureichenden Mengen produziert. Um die Erforschung neuer Naturstoffe sowohl aus C. asteris als auch aus A. cruciatus zu erleichtern, ist es notwendig, das Methodenspektrum zu erweitern. Dazu gehören insbesondere die genetische Manipulation des natürlichen Produzentenstammes sowie die heterologe Expression eines stammspezifischen Genclusters unter Verwendung eines etablierten Modellorganismus als heterologe Produktionsplatform. In Anbetracht des Scheiterns einer Vielzahl früherer Versuche zur PEG-vermittelten Protoplastentransformation von C. asteris verblieb als einzige Strategie zur Erweiterung des Instrumentariums die heterologe Expression. Der Versuch der heterologen Produktion von Astinen in Aspergillus nidulans, der als genereller Machbarkeitsnachweis dienen sollte, war jedoch erfolglos, sodass sich die Erforschung von Naturstoffen weiterhin auf rein fermentative Strategien beschränkt. Im Gegensatz dazu konnte die heterologe Produktion von Lajollamid A, das ursprünglich aus A. cruciatus isoliert wurde, unter Verwendung von A. nidulans als heterologer Wirt erfolgreich realisiert werden. Zusätzlich konnte eine Vielzahl von Derivaten durch Vorläufer-dirigierte heterologe Biosynthese erzeugt werden, was den Nutzen dieser biotechnologischen Produktionsplattform weiter unterstreicht. Darüber hinaus wurde ein Protokoll für die PEG-vermittelte Protoplastentransformation von A. cruciatus entwickelt. Im Gegensatz zu den meisten filamentösen Pilzen konnten stabile Transformanten nur unter Verwendung replikativer Plasmide, die über die AMA1-Sequenz als funktionales Replikon verfügen, erzeugt werden. Die zirkuläre Topologie des eingeführten Plasmids wurde durch eine Kombination aus diagnostischen PCRs und vergleichender Ganzgenomsequenzierung bestätigt. In der Gesamtschau lässt sich festhalten, dass die Methodik zur Naturstoff forschung in A. cruciatus um die Strategie der heterologen Expression und der genetischen Manipulierbarkeit des natürlichen Produzenten erweitert werden konnte.