Mass Spectrometry-Based Proteomic Strategies for the Characterization, Identification, and Quantification of Insect Proteins in Novel Foods

Abstract

The growing global demand for sustainable and alternative protein sources has increased interest in edible insects. Their regulatory approval in the European Union as novel food and feed ingredients necessitates reliable analytical methods to ensure food safety, authenticity, and allergen risk assessment. This thesis addresses these challenges by developing and validating mass spectrometry-based proteomic workflows for insect protein characterization, identification, and quantification. A novel homology-based nano-HPLC-HR-MS approach was established to overcome the major limitation posed by the lack of comprehensive, species-specific protein databases. Up to 1893 proteins were identified across six insect species Acheta domesticus, Locusta migratoria, Tenebrio molitor, Alphitobius diaperinus, Gryllodes sigillatus, and Hermetia illucens, representing up to a 24-fold increase in available proteomic data. Approximately 90% of tested peptides were further confirmed by parallel reaction monitoring, demonstrating the reliability of the workflow. The allergenic potential was assessed and conserved allergens such as tropomyosin were detected across all species, while species-specific allergens indicated further unique allergenic risks. Species-specific marker peptides and a novel, conserved pan-insect tropomyosin marker were identified and used to develop a targeted immunoaffinity LC-MS/MS assay for authentication and quantification of five insect species, as well as for general insect protein detection. The immunoenrichment strategy enabled efficient sample cleanup following direct in-suspension proteolysis and supported rapid chromatographic separations with a total cycle time of six minutes. The assays’ basic analytical parameters were validated, demonstrating high accuracy, precision, selectivity, and sensitivity. It enabled reliable detection of insect proteins in both commercial products and model food matrices at concentrations relevant for allergen monitoring. In conclusion, this thesis develops and applies novel analytical tools for the comprehensive proteomic characterization of non-sequenced insect species and delivers methodologies for both qualitative and quantitative detection of insect proteins in food, supporting food safety, traceability, and regulatory compliance.

Die weltweit steigende Nachfrage nach nachhaltigen und alternativen Proteinquellen hat das Interesse an essbaren Insekten erheblich gesteigert. Ihre Zulassung als neuartige Lebensmittel und als Futtermittelzutaten in der Europäischen Union erfordert zuverlässige Analysemethoden, um die Lebensmittelsicherheit, -authentizität und Allergenrisikobewertung zu gewährleisten. Diese Arbeit addressiert diese Herausforderungen, indem sie massenspektrometriebasierte proteomische Methoden für die Charakterisierung, Identifizierung und Quantifizierung von Insektenproteinen entwickelt und validiert. Um die größte Einschränkung durch das Fehlen umfassender, artspezifischer Proteindatenbanken zu überwinden, wurde ein neuartiger homologiebasierter Nano-HPLC-HR-MS-Ansatz entwickelt. Bis zu 1893 Proteine aus den sechs Insektenarten Acheta domesticus, Locusta migratoria, Tenebrio molitor, Alphitobius diaperinus, Gryllodes sigillatus und Hermetia illucens konnten identifiziert werden, was einer bis zu 24-fachen Steigerung der verfügbaren Proteomdaten entspricht. Etwa 90 % der getesteten Peptide wurden durch Parallel Reaction Monitoring weiter bestätigt, was die Zuverlässigkeit der Methode demonstriert. Das allergene Potenzial wurde bewertet und konservierte Allergene, wie Tropomyosin, wurden bei allen Arten nachgewiesen, während artspezifische Allergene auf weitere einzigartige allergene Risiken hinwiesen. Artspezifische Markerpeptide und ein neuartiger, konservierter Pan-Insekten Marker aus Tropomyosin wurden identifiziert und zur Entwicklung eines gezielten Immunoaffinitäts-LC-MS/MS-basierten Testverfahrens zur Authentifizierung und Quantifizierung von fünf Insektenarten sowie zum allgemeinen Nachweis von Insektenproteinen verwendet. Die Immunoaffinitätsstrategie ermöglichte eine effiziente Probenreinigung nach direkter Proteolyse in Suspension und unterstützte schnelle chromatographische Trennungen mit einer Gesamtzykluszeit von sechs Minuten. Die grundlegenden analytischen Parameter des Testverfahrens wurden validiert und zeigten eine hohe Genauigkeit, Präzision, Selektivität und Sensitivität. Dies ermöglichte einen zuverlässigen Nachweis von Insektenproteinen sowohl in kommerziellen Produkten als auch in Modellnahrungsmatrizen in Konzentrationen, die für die Allergenüberwachung relevant sind. Zusammenfassend entwickelt und wendet diese Arbeit neue analytische Werkzeuge zur umfassenden proteomischen Charakterisierung nicht sequenzierter Insektenarten an und stellt validierte Methoden für den qualitativen und quantitativen Nachweis von Insektenproteinen in Lebensmitteln bereit. Dies trägt zur Gewährleistung der Lebensmittelsicherheit, Rückverfolgbarkeit und regulatorischen Konformität bei.