HepaChip-MP: a microfluidic liver model in multiwellplate format for the assessment of metabolism, toxicity and modeling of disease as an example of microfluidic in vitro models to mimic physiological organ behavior

Abstract

Durch Medikamente hervorgerufene Schädigungen und insbesondere medikamenteninduzierte Leberschäden (DILI, drug-induced liver injury) stellen ein großes gesundheitliches Problem dar. Ein Grund dafür ist, dass die derzeit verwendeten präklinischen Modelle die Wirkungen von Substanzen auf Menschen nicht zuverlässig vorhersagen können. Organ-on-Chip-Modelle sind vielversprechende Systeme um verbesserte Vorhersagen tätigen zu können. Der HepaChip-MP ist ein solches Organ-on-Chip-System. Er modelliert die kleinste Einheit der Leber, den Lebersinusoid. Ziel dieser Arbeit war es, die Anwendbarkeit dieses Chipsystems zu demonstrieren, indem primäre humane Hepatozyten darin kultiviert und leberspezifische Zellfunktionen untersucht sowie substanzinduzierte Zellschäden nachgewiesen werden. In dieser Arbeit wurden Zellkulturprozesse etabliert, um primäre humane Hepatozyten zu assemblieren, zu kultivieren und zu analysieren. Die Handhabung des HepaChip-MP mit einem Pipettierroboter wurde optimiert, um die Wiederholbarkeit von Experimenten und die Benutzerfreundlichkeit für nicht erfahrene Endanwender zu verbessern. Nach der Optimierung der Prozesse konnten im Durchschnitt mehr als 18 der 24 Kammern des Chips pro Experiment verwendet werden. Außerdem konnte erreicht werden, dass die Zellen die Zellkulturbereiche bedecken. Nach der Optimierung der technischen Aspekte der Chip-Handhabung wurden verschiedene Medien zur Unterstützung der Langzeitkultur getestet. Es wurde ein Medium gefunden, das die Kultivierung dichter Zellaggregate für mindestens 12 Tage auf dem Chip unterstützt. Es wurden Assays zur Analyse der Zellvitalität und -funktion entwickelt. Ein Resazurin-Assay und ein ATP-Assay wurden an den HepaChip-MP angepasst und anschließend zum Nachweis von Diclofenac- und Acetaminophen-induzierten Zellschäden eingesetzt. Die Funktion und Induktion von Cytochrom P450 (CYP)-Enzymen wurde über den Nachweis der Produkte der Metaboliserung von bestimmten Substraten nachgewiesen (mittels Massenspektrometrie durchgeführt von A & M Labor für Analytik und Metabolismusforschung Service GmbH Bergheim, Deutschland). Außerdem wurde eine Kokultur aus humanen primären Hepatozyten und humanen primären Leberendothelzellen etabliert. Die verschiedenen Zelltypen wurden mit zelltypspezifischen Antikörpern angefärbt. Dadurch konnte gezeigt warden, dass es möglich ist verschiedene Zelltypen im HepaChip-MP zu kultivieren. In Zusammenarbeit mit Kollegen der Technischen Universität Graz (Graz, Österreich) und der Pyroscience AT GmbH (Aachen, Deutschland) wurden Sauerstoffsensoren in den HepaChip-MP eingebaut, die eine Online-Messung des Sauerstoffverbrauchs ermöglichen. Dies ermöglichte eine detaillierte Analyse der substanzinduzierten Auswirkungen auf die Zellatmung. Zusammenfassend wurden Verfahren zur Analyse der Zellvitalität und -funktion nach Substanzbehandlung in einem innovativen parallelisierten Organ-on-Chip-System des Lebersinusoids etabliert. Die Handhabung des Chip-Systems ist automatisiert mit einem Pipettierroboter möglich. Es wurde leberspezifische Zellfunktion gezeigt und insbesondere die Online-Messung des Sauerstoffverbrauchs unter kontinuierlichen Flussbedingungen nach Behandlung mit verschiedenen Substanzen etabliert. Dies zeigt das große Potenzial für weitere detailierte Untersuchungen mit der HepaChip-MP.

Drug-induced injury and especially drug-induced liver injury (DILI) are a big health concern. One reason for this is that preclinical models currently in use fail to predict substance effects in humans reliably. Organ-on-chip models are promising systems to improve these effects. The HepaChip-MP is such an organ-on-chip system modelling the liver sinusoid. The aim of this thesis was to demonstrate usability of this chip system by culturing primary human hepatocytes in it and showing liver-specific cell function as well as detecting substance-induced cell damage. In this thesis, cell culture processes were established to assemble, culture, and analyze primary human hepatocytes. Handling of the HepaChip-MP with a pipetting robot was optimized to improve repeatability of experiments and ease-of-use for non-expert end-users. After optimizing the process to prepare and fill the cell culture chambers, on average more than 18 of the 24 chambers of the chip could be used per experiment. Also, the process for cell assembly was optimized which led to mostly complete coverage of the cell culture areas with cells at the start of the culture. After optimizing the technical aspects of chip handling, different media compositions were investigated in order to improve long-term stability of cell culture in the HepaChip-MP. A medium was identified which supports dense cell aggregates for at least 12 days in the chip. Assays were established to analyze cell vitality and function. A resazurine assay and an ATP-assay were adapted to the HepaChip-MP and used to detect diclofenac- and acetaminophen-induced cell damage. Function and induction of cytochrome P450 (CYP) enzymes was demonstrated via substance turnover (mass spectrometry analysis conducted by A & M Labor fuer Analytik und Metabolismusforschung Service GmbH Bergheim, Germany). Also, a coculture of human primary hepatocytes and human primary liver endothelial cells was established. The different cell types were stained with cell type specific antibodies which demonstrated the possibility to assemble different cell types in the HepaChip-MP. Oxygen sensors were introduced in the HepaChip-MP in collaboration with colleagues from Graz University of Technology (Graz, Austria) and Pyroscience AT GmbH (Aachen, Germany) allowing online measurement of oxygen consumption. This allows for a detailed analysis of substance-induced effects on cellular respiration. In conclusion, procedures have been established to analyze cell vitality and function after substance treatment in an innovative parallelized organ-on-chip system of the liver allowing for automated handling with a pipetting robot. Liver specific cell function was shown and especially, online measurement of oxygen consumption under continuous flow conditions after substance treatment has been established.