Chemically Modified guideRNAs are Resilient and Allow for Precise and Efficient Targeted A-to-I and C-to-U Editing

Abstract

RNA-Editierung beschreibt einen natürlichen zellulären Vorgang, bei dem Adenosine oder Cytidine innerhalb eines RNA-Moleküls desaminiert werden. Dabei entsteht bei ersterem, Inosin, das sich wie Guanosin verhält und als solches auch von zellulären Proteinen, wie der Translationsmaschinerie erkannt wird. Dabei können unter anderem innerhalb einer kodierenden Sequenz Punktmutation von Adenosin nach Guanosin entstehen. Dieser Vorgang wird in der Zelle von Proteinen der ADAR-Familie ausgeführt. Die Desaminierung von Cytidin nach Uridin hat in ApoB ihr bekanntestes Beispiel. Hierbei führt die von APOBEC-1 ausgeführte Desaminierung dazu, dass das ApoB-100 Protein im Darm als verkleinertes ApoB-48 Protein vorzufinden ist. Neben APOBEC-1 wurden lediglich APOBEC-3A und -3G als Cytidin-desaminierende Proteine von RNA beschrieben. Die anderen Familienmitglieder der AID/APOBEC-Familie desaminieren für gewöhnlich Cytidine innerhalb von DNA-Molekülen. Das Potential, das diese Prozesse bergen führte zur Entwicklung zahlreicher Ansätze für eine zielgerichtete Anwendung. Für die A-nach-I-Editierung entstanden Ansätze, die entweder endogen exprimierte ADAR zielgerichtet rekrutieren oder aber von Fusionsproteinen Gebrauch machen, die aus der Desaminasedomäne der ADARs besteht und einem Proteinanteil, der die Translokation zur Zielsequenz vermittelt. Im Gegensatz dazu, wurden für die C-nach-U-Editierung ausschließlich Fusionsprotein entwickelt, die auf der katalytischen Aktivität von entweder endogenen Desaminasen (APOBEC-1, -3A, -3G) oder aber mutierten ADAR-Desaminasedomänen basieren. Während die Plattformen für A-nach-I Editierung weitestgehend effektiv sind, leiden die entwickelten Cytidindesaminasen entweder unter geringer Effektivität und/oder stark eingeschränktem Spektrum and zu editierenden Codons. Daher liegt das Bestreben dieser Arbeit darin das Feld der zielgerichteten RNA-Editierung anhand der nötigen Stellschrauben zu avancieren. Auf der einen Seite können wir hier zeigen, dass das SNAP-ADAR-System gängige chemische Modifikationen der guideRNA, die bereits in großem Umfang in anderen Oligonukleotideanwendungen Verwendung finden, nicht nur toleriert, sondern, dass diese sogar die Editierung verbessern können. Auf der anderen Seite können wir zeigen, dass diese chemischen Modifikationen auch zu einer stark erhöhten Stabilität der guideRNAs in extrem unwirtlichen Medien führen. Darüber hinaus ist es uns hier gelungen ein Modifikationsmuster zu entwickeln, das uns erlaubt in Zellkultur auf endogenen Transkripten zielgerichtet A nach I zu editieren, ohne auf Reagenzien angewiesen zu sein, um die guideRNAs in die Zelle zu schleusen. Ferner ist es uns gelungen die SNAP-ADAR-Plattform um ein weiteres Enzym zur Interaktion mit der guideRNA zu erweitern. Somit haben wir mit diesem HALO-tag nicht nur eine Alternative zum SNAP-tag, sondern können auch unterschiedliche Effektoren zur Manipulation von RNA unabhängig voneinander und, aufgrund der hohen Substratspezifität, sogar gleichzeitig nutzen. Folglich ist es uns gelungen gleichzeitig A nach I und C nach U zu editieren. Letzteres gelang durch das Fusionieren von SNAP-tag mit der endogenen Cytidindesaminase APOBEC-1, welche jedoch aufgrund von mangelnder Kontrollierbarkeit eine suboptimale Plattform darstellte. Daraufhin bemühten wir SNAP-tag um eine bessere Plattform für zielgerichtete C nach U Editierung zu erschaffen, indem wir es mit einer mutierten ADAR2 Desaminasedomäne fusionierten, welche Cytidine als Substrat für Desaminierungen akzeptiert. Innerhalb des Cas13-basiertem RESCUE-S-System wurde es als kontrollierbar und mit einem breiten Spektrum an editierbaren Codons beschrieben. Indem wir Cas13 mit dem SNAP-tag austauschten, erschufen wir SNAP-CDAR-S, ein Enzym mit maximaler Programmierbarkeit, hoher Effektivität bei ausgezeichneter Genauigkeit und sehr breitem Wirkspektrum. Ähnlich wie bei SNAP-ADAR, ermöglichte das Zusammenspiel mit chemisch modifizierten guideRNAs eine hohe Editierungsausbeute von schwer zu editierenden Codons ohne an Genauigkeit einzubüßen. Zusammengenommen können die hier vorgelegten Ergebnisse den Grundstein einer vielseitigen Plattform legen, die es erlauben könnte, verschiedene Arten von RNA-Modifikationen zeitgleich, effizient und aufgrund von hoher Stabilität potenziell sogar zielgerichtet auf Geweben oder Organen innerhalb komplexer Lebewesen anzuwenden.

Deamination of adenosines and cytidines is mediated by the ADAR and AID/APOBEC families. The former family deaminates adenines in double-stranded RNA molecules leaving behind inosine, which acts as guanosine and is as such interpreted by ribosomes. The AID/APOBEC family deaminates cytidines primarily in DNA molecules but three of them were described to edit RNA. The most prominent of those three is APOBEC-1, which by deamination of cytidine creates a uridine leading to a Stop codon formation and is therefore responsible for the intestinal switch from ApoB-100 to ApoB-48 and thus substantially impacts lipid metabolism. Given the significance and potential of those processes, extensive efforts have been made to control and employ them. For A-to-I editing, multiple applications have been developed that either rely on endogenous levels of ADARs or on an over-expressed fusion of their deaminase domains and a protein promoting translocation to the target site. For both classes of applications, almost all tools rely on a guideRNA for flagging the target site by creating a double-strand with the target adenosine in a mismatch with cytidine and bearing some kind of structure for recruitment of the editing enzyme. Some of those tools rely on synthetic guideRNAs bearing common chemical modifications for stability (e.g. SNAP-ADAR) and some rely on plasmid-encoded guideRNAs. For targeted C-to-U editing, all reported tools rely on over-expressed fusion proteins with either an endogenous cytidine deaminase (e.g. APOBEC-1/-3A) or mutated ADAR2 deaminase domain. While for targeted A-to-I editing tools vary in efficacy but broadly show high-level editing across a multitude of targets, tools for targeted C-to-U editing suffer from either low editing levels and/or limited codon scope. In this work we further advance both branches of the field. By expanding chemical modification patterns of guideRNAs for SNAP-ADAR-mediated A-to-I editing we created a design that does not just retain almost full stability in extremely hostile environment up to a week of incubation but also allows for naked and carrier-free delivery to cells for editing of an endogenous transcript. In addition, we successfully augmented the highly potent SNAP-ADAR platform by HALO-tag. In fact, with HALO-tag we did not just provide an alternative to SNAP-tag, but we successfully recruited different effectors to different target sites simultaneously. This way, we ultimately employed two enzymes for concurrent A-to-I and C-to-U editing, the latter of which we achieved by fusion of SNAP-tag with the endogenous cytidine deaminase APOBEC-1 named mApo1S. However, erratic and low activity of mApo1S prompted us to explore other possibilities and we thus considered RESCUE-S, a fusion of a mutated ADAR2 deaminase domain, capable of cytidine deamination, with a Cas13 protein. By exchanging Cas13 with the SNAP-tag we created SNAP-CDAR-S, a versatile tool with maximum programmability, high activity, and accuracy, which provides a valuable alternative to other current tools. In conclusion, the work presented here paves the way for a future multifaceted platform for eliciting various potentially multiplexed effects on target RNAs, which due to compound stability could even be applied to specific tissues or organs in complex living organisms.