Targeted lipidomics of low abundant lipid signaling molecules: Clinical analysis of steroids and endocannabinoids

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dc.contributor.advisor Lämmerhofer, Michael (Prof. Dr.)
dc.contributor.author Aydin, Ece
dc.date.accessioned 2024-02-19T15:51:03Z
dc.date.available 2024-02-19T15:51:03Z
dc.date.issued 2024-02-19
dc.identifier.uri http://hdl.handle.net/10900/151160
dc.identifier.uri http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-dspace-1511602 de_DE
dc.identifier.uri http://dx.doi.org/10.15496/publikation-92500
dc.description.abstract Unter Lipidomik versteht man die Untersuchung aller oder eines Teils der Lipide in einer biologischen Probe sowie ihres Stoffwechsels, biologischer Prozesse und Funktion, wie z. B. Krankheiten. Obwohl Lipidomik zu den neueren Forschungsgebieten der Omics gehört, nimmt ihre Bedeutung zu, da immer mehr Menschen erkennen, dass neben Genen und Proteinen auch andere Faktoren den Zustand biologischer Systeme beeinflussen. In den letzten zehn Jahren ist die Lipidomik schnell gewachsen, da sie neue Forschungsbereiche zur Rolle von Lipiden in der Zellbiologie, Gesundheit und Krankheit eröffnet hat, und es handelt sich um ein kontinuierlich wachsendes Forschungsgebiet. Durch die Identifizierung von Veränderungen im Lipidzustand und die Suche nach pathogenen Mechanismen, die zu Lipid-assoziierten Störungen führen, kann Lipidomik bei der Entdeckung und Entwicklung neuer Medikamente von Nutzen sein. Mithilfe der gezielten Lipidomik wird eine genau definierte spezifische Gruppe von Lipiden genau quantifiziert. Die gezielte Lipidomik konzentriert sich auf bestimmte interessierende Verbindungen, anstatt zu versuchen, die gesamten Lipidklassen abzudecken. Im Vergleich zur nicht gezielten Lipidomik werden weniger qualitative Daten erfasst, die gezielte Lipidomik ist jedoch empfindlicher und ermöglicht die Analyse der gezielten Analyten. Während in der nicht gezielten Lipidomik hochauflösende Massenspektrometer eingesetzt werden, werden in der fokussierten Lipidomik sehr empfindliche Massenspektrometer wie Triple Quadrupole (QqQ) verwendet. Der Einsatz quadrupolbasierter Instrumente für gezielte Anwendungen hat in den letzten Jahrzehnten zugenommen, da Fortschritte in der Methodik die Verfügbarkeit der Technologie verbesserten. Um Vergleiche einer bestimmten Gruppe von Lipiden (z. B. Biomarkern, Verbindungen mit geringem Vorkommen oder Signalwegen) zu ermöglichen, wie sie üblicherweise in klinischen, biochemischen oder industriellen Forschungsanwendungen vorkommen, wurden Anstrengungen unternommen, um sowohl die Selektivität als auch den Durchsatz zu verbessern. In den letzten zehn Jahren haben technologische Innovationen die Scangeschwindigkeit von Dreifach-Quadrupol-Instrumenten deutlich erhöht und die Messung von mehr als 600 Übergängen pro Sekunde und mehr als 200 Lipidzielen auf einem modernen Triple-Quadrupol-Instrument ermöglicht. In dieser kumulativen Doktorarbeit wurden LC-MS-basierte Lipidomik-Assays entwickelt, um die besten Bedingungen für die Untersuchung von niedrig abundanten Lipiden wie Steroiden und Endocannabinoidarten zu schaffen. Im Rahmen der ersten Studie wurde eine gezielte LC-MS/MS-Methode für Speichelcortisol und Kortison entwickelt und anschließend validiert. Da Speichel und andere nicht-invasive Probenahmematrizen bevorzugt werden, werden Kortisol und Kortison häufig als Indikatoren für Stress verwendet. Da Immunoassays aufgrund von Kreuzreaktivitäten weniger spezifisch sind, werden sie dennoch häufig zur Messung des Steroidhormonspiegels eingesetzt. Zur Quantifizierung von Steroidhormonen werden derzeit überwiegend LC-MS/MS-basierte empfindliche Methoden eingesetzt. Aus diesem Grund war das Ziel dieser Studie die Entwicklung einer neuartigen Mikrofluss-UHPLC-ESI-MS/MS-Technik mit MRM-Datenerfassung für eine groß angelegte langfristige Neuroimaging-Stressstudie zur Messung von Kortisol und Kortison im Speichel zu entwickeln. Dank ihres Mikroflusses Regime ermöglicht die Methode eine verbesserte Empfindlichkeit und ist umweltfreundlicher. Der Überdruck-Elutionsmodus und die Offline-SPE mit Oasis PRIME HLB im 96-Well-Plattenformat ermöglichten eine hervorragende Probenvorbereitung mit hohem Durchsatz und der Fähigkeit, Matrixeffekte effektiv zu entfernen. Mit dem erworbenen SPE-Anreicherungsfaktor von 14 begünstigte das Mikroflussregime der Kapillarchromatographie-Skala (20 μL min-1) eine effektive Elektrospray-Ionisierung und erzeugte eine empfindliche Quantifizierungstechnik für Kortisol/Kortison-Steroide (LLOQ von Kortisol/Kortison, 72/62 pg mL-1). Die Bewertung der Kortisol- und Kortisonkonzentrationen in verschiedenen Probenchargen aus Studienproben mit normalem klinischem Stress (insgesamt 4056 Injektionen mit 1983 Studienproben) erwies sich letztendlich als wirksam. Darüber hinaus schwankte die Geräteleistung der fünf untersuchten Kapillarsäulen im Laufe der Zeit, einschließlich der Schwankungen der Retentionszeit innerhalb jeder Charge, zwischen den Chargen und von Charge zu Charge während der Studie, die zwei Jahre dauerte. Die Forschung zeigt, dass Mikro-UHPLC-ESI-MS/MS bei Verwendung geeigneter interner Standards ausreichend und zuverlässig genug ist, um eine umfassende klinische Untersuchung mit mehr als 1000 Proben über einen langen Zeitraum durchzuführen. Meine zweite Studie umfasste die Entwicklung und Validierung einer neuen UHPLC-ESI-MS/MS-Methode zur Trennung und Bestimmung von Endocannabinoiden in Zerebrospinalflüssigkeitsproben geringer Menge. Endocannabinoide sind körpereigene Fettsäurederivate, die Cannabinoidrezeptoren aktivieren. In den realen Proben konnten sechs Endocannabinoid-Analyten (1/2-AG, 2-AGE, AEA, LEA, PEA und OEA) in einem einzigen chromatographischen Lauf mit guter Empfindlichkeit, hoher Genauigkeit und in kurzer Analysezeit gemessen werden (5.5 Minuten). Die hier beschriebene Methode ist unkompliziert, robust und aufgrund ihrer kurzen Analysezeit und der Fällungs-/Extraktionsphase einzelner Proteine für einen hohen Durchsatz geeignet. Soweit uns bekannt ist, ist dies die erste validierte Technik, die zwei Kalibrierungsverfahren in Zerebrospinalflüssigkeitsproben verwendet: Surrogatkalibrantmethode und Surrogatmatrixmethode, insbesondere zur Quantifizierung von 2-AG, 2-AGE, AEA, LEA, PEA und OEA in Zerebrospinalflüssigkeitsproben. Ziel des dritten Projekts war die Entwicklung einer schnellen, empfindlichen, zuverlässigen und reproduzierbaren LC-MS/MS-Technik zur Messung von Melatonin und Cortisol im Speichel, um den Schlaf-Wach-Rhythmus bei gesunden Probanden zu untersuchen und die Schlaf-Wach-Zyklen mit denen von Parkinson-Patienten zu vergleichen. Die Technik muss schnell und einfach sein und den geringsten Aufwand an Probenvorbereitung erfordern. Sie wurde anhand einer Reihe von Speichelproben gesunder Teilnehmer evaluiert, um Veränderungen der Cortisol- und Melatoninkonzentrationen über einen Zeitraum von 24 Stunden in einem zirkadianen Rhythmus zu überwachen. Die Laufzeit von 6 Minuten pro Probe in der klinischen Forschung ermöglichte einen hohen Durchsatz. Um die Empfindlichkeit zu verbessern, wurden verschiedene Parameter verglichen. Es wurde eine RPLC-ESI-MS/MS-Methode mit LOQs von 15 pg/ml für Melatonin und 104 pg/ml für Kortisol im Speichel entwickelt. Der nachweisbare Melatoninspiegel lag jedoch bereits über den Grundwerten in Speichelproben, obwohl verschiedene Optimierungen durchgeführt wurden, um die Empfindlichkeit zu verbessern, sind weitere Untersuchungen erforderlich. de_DE
dc.description.abstract Lipidomics is the study of all or a fraction of the lipids in a biological sample as well as their metabolism, biological processes, and features, such as diseases. Although lipidomics is one of the most recent -omics study areas, its significance is expanding as more people realize that other factors besides genes and proteins affect the condition of biological systems. Over the past ten years, lipidomics has grown quickly since it has introduced new areas of research into the role of lipids in cell biology, health, and disease and it is a continuously growing research field. By identifying changes in lipid states and searching for pathogenic mechanisms that result in lipid-associated disorders, lipidomics can benefit in the discovery and development of new drugs. A well-defined specific group of lipids is accurately quantified using targeted lipidomics. Targeted lipidomics focuses on certain compounds of interest rather than trying to cover the whole lipid classes. Compared to non-targeted lipidomics, less qualitative data is acquired, but targeted lipidomics is more sensitive and enables accurate analysis of the targeted analytes. In fact, while high resolution mass spectrometers are employed in non-targeted lipidomics, very sensitive mass spectrometers, such as triple quadrupoles (QqQ), are used in targeted lipidomics. The utilization of quadrupole-based instruments for focused applications has increased over the past couple of decades as advances in methodology enhanced the technology's availability. To enable comparisons of a certain group of lipids (such as biomarkers, low abundant compounds, or pathways), such as those usually seen in clinical, biochemical, or industrial research applications, efforts have been undertaken to improve both the selectivity and throughput. Over the past ten years, innovations in technology have significantly increased the scanning speed of triple quadrupole instruments, enabling the measurement of more than 600 transitions per second and more than 200 lipid targets on a contemporary triple quadrupole instrument. In this cumulative doctoral dissertation, LC-MS based lipidomics assays have been developed to establish the best conditions to study low abundant clinically relevant lipids such as steroids and endocannabinoid species. Within the first study, a targeted LC-MS/MS method of salivary cortisol and cortisone was developed and then validated. Since saliva and other non-invasive sampling matrices have been preferred, cortisol and cortisone are commonly used as indicators of stress. Due to the fact that cross-reactivities make immunoassays less specific, they are nonetheless often employed for measuring steroid hormone levels. Currently LC-MS/MS-based sensitive methods are mostly used for quantification of steroid hormones. For that reason, the goal of this study was to develop a novel microflow UHPLC-ESI-MS/MS technique with MRM data acquisition for a large-scale long-term neuroimaging stress study for measuring salivary cortisol and cortisone that, thanks to its microflow regime, enables improved sensitivity and is more environmentally friendly. Positive pressure elution mode and offline SPE with Oasis PRIME HLB in 96-well plate format enabled excellent sample preparation with high throughput and the ability to effectively remove matrix effects. With the acquired SPE enrichment factor of 14, the capillary chromatography scale's microflow regime (20 μL min-1) favored effective electrospray ionization and produced a sensitive cortisol/cortisone steroid quantification technique (LLOQ of cortisol/cortisone, 72/62 pg mL-1, respectively). The evaluation of cortisol and cortisone concentrations in various batches of samples from normal clinical stress study samples (4056 total injections with 1983 study samples) was effective in the end. Furthermore, the instrument performance of the five capillary columns under investigation varied throughout time, including the retention time variations within each batch, across batches, and from lot to lot during the study took 2 years. The research shows that, if appropriate internal standards can be utilized, micro-UHPLC-ESI-MS/MS is sufficient and reliable enough to conduct a comprehensive clinical investigation with more than 1000 samples over a long period of time. The second study involved the development and validation of a new UHPLC–ESI-MS/MS method for endocannabinoid separation and determination in low-quantity CSF (cerebrospinal fluid) samples. Endocannabinoids are fatty acid derivatives produced from within the body that activate cannabinoid receptors. In the real samples, six analytes of endocannabinoids (1/2-AG, 2-AGE, AEA, LEA, PEA, and OEA) could be measured in a single chromatographic run with good sensitivity, high accuracy, and in a short analysis time (5.5 min). The approach described here is straightforward, robust, and capable of high throughput due to its quick analysis time and single protein precipitation/extraction phase. As far as we are aware, this is the first validated technique that used two calibration procedures in CSF samples: surrogate calibrant and surrogate matrix method especially for quantification of 2-AG, 2-AGE, AEA, LEA, PEA, and OEA in CSF. The third project intended to develop quick, sensitive, reliable, and reproducible LC-MS/MS technique for melatonin and cortisol measurement in saliva to investigate the sleep-awake rhythm in healthy volunteers and compare the sleep-awake cycles with Parkinson patients. The technique must be quick and simple, requiring the least amount of sample preparation and it was evaluated using a range of saliva samples from healthy participants to monitor changes in cortisol and melatonin concentrations over the course of a 24-hour period in a circadian rhythm. The run time of 6 minutes per sample in clinical research allowed for a high throughput. Different parameters were compared to improve the sensitivity. A RPLC-ESI-MS/MS method was developed with LOQs of 15 pg/mL for melatonin and 104 pg/mL for cortisol in saliva. Despite several optimizations being made to increase the LC-MS/MS sensitivity and the detection limits, the melatonin amount that could be measured in saliva samples was already above the baseline values, thereby further research is needed. en
dc.language.iso en de_DE
dc.publisher Universität Tübingen de_DE
dc.rights ubt-podok de_DE
dc.rights.uri http://tobias-lib.uni-tuebingen.de/doku/lic_mit_pod.php?la=de de_DE
dc.rights.uri http://tobias-lib.uni-tuebingen.de/doku/lic_mit_pod.php?la=en en
dc.subject.ddc 500 de_DE
dc.subject.ddc 540 de_DE
dc.subject.other analytische chemie de_DE
dc.subject.other Massenspektrometrie de_DE
dc.subject.other Chromatographie de_DE
dc.subject.other Methodenentwicklung de_DE
dc.subject.other lipidomik de_DE
dc.subject.other steroide de_DE
dc.subject.other hplc de_DE
dc.subject.other hplc en
dc.subject.other steroids en
dc.subject.other lipidomics en
dc.subject.other mass spectrometry en
dc.subject.other mass spectrometry en
dc.subject.other analytical chemistry en
dc.subject.other Method development en
dc.title Targeted lipidomics of low abundant lipid signaling molecules: Clinical analysis of steroids and endocannabinoids en
dc.type PhDThesis de_DE
dcterms.dateAccepted 2023-11-20
utue.publikation.fachbereich Pharmazie de_DE
utue.publikation.fakultaet 7 Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät de_DE
utue.publikation.noppn yes de_DE

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