Advanced lateral flow assays for point of care diagnostics

Abstract

Lateral Flow Assays (LFAs) für den Einsatz in medizinischen Anwendungen sind ein wichtiges Werkzeug für die schnelle und zuverlässige Diagnose vor Ort, durch den Patienten selbst und/oder medizinisches Fachpersonal. LFAs bieten verwertbare Informationen in einer Analysezeit von ≤ 30 min, wobei besonders schnelle Tests auch in weniger als 5 min Ergebnisse liefern können. Diese Diagnoseinstrumente sind deshalb perfekt geeignet für Anwendungen in den Bereichen Präzisionsmedizin und der patientennahen Diagnostik vor Ort, wenn sofort verfügbare Informationen oder kosteneffiziente Tests zur Überwachung von Medikamentenspiegeln benötigt werden. Wenn präzise quantitative Ergebnisse gebraucht werden, ist der Einsatz technischer Messgeräte unverzichtbar. Diese müssen tragbar und nach Möglichkeit günstig, sowie leicht verfügbar sein. Aus diesem Grund sind moderne Smartphones mit hochwertigen Kamerasystemen und starker Rechenleistung eine hervorragende Wahl. Aufgenommene Fotos können dabei unter den richtigen Rahmenbedingungen ähnlich gute Ergebnisse liefern wie professionelle Laborgeräte. Zusätzlich zum gewählten Messgerät ist das verwendete Label, bzw. Farbstoff, eine bestimmende Größe für die Leistungsfähigkeit, insbesondere für die Sensitivität und multiplex Eignung, eines LFA. Hier kommen meist Gold-Nanopartikel (AuNPs) zur Anwendung. Insgesamt wurden 3 LFA Tests für den Einsatz zum Monitoring von Digoxin und zur Analyse der Entzündungs- und Koagulationsbiomarker C-reaktives Protein (CRP), Interleukin-6 (IL-6) und Thrombin in Blutproben erforscht und die Ergebnisse publiziert. Gute Resultate wurden dabei in den Themenbieten Smartphone Bildgebung, sowie optisches Multiplexing, durch den Einsatz von grünen und roten, sog. Quantenpunkten (QDs) als Label, erzielt. Im ersten Teil wurde ein Low-Tech Smartphone-Auswertungssystem für die Blutspiegelanalyse des Herzglykosids Digoxin erstellt. Dazu wurden Fotos von einem iPone 5S, unter Verwendung einer einfachen Dunkelkammer aus schwarzem Karton, aufgenommen und mit einer individuell programmierten Shiny app ausgewertet. Die quantitativen Ergebnisse wurden mit den Messdaten eines professionellen Labor Imager verglichen, wodurch wir zeigen konnten, dass es nur geringe Unterschiede in den erreichten Assay Kennzahlen gibt (19.8 bzw. 16.9 nmol/L Detektionslimit). Der 10 Digoxin LFA deckt den therapeutisch relevanten Bereich ab, so dass er für das Monitoring dieses potentiell toxischen Medikaments, mit einem schmalen therapeutischen Fenster, in kurzen Intervallen geeignet ist. Es wurden Gold- Nanopartikel mit 50nm Durchmesser in einem kompetitiven Format verwendet. Der kolorimetrische Assay ist mit den meisten kommerziell erhältlichen, professionellen Messgeräten auswertbar, weil die verwendeten AuNP Farbstoffe dem meistverwendeten Typ entsprechen und daher kompatibel sind. Der Test bewies exzellente Leistung und ist geeignet für kosteneffiziente Anwendungen im Monitoring von Therapeutika, zu Haus, oder in ressourcenarmen Umgebungen. Die Verwendung von Gold Nanopartikel Farbstoffen ohne Nachbearbeitungsschritte hat jedoch Beschränkungen in der Sensitivität und der Eignung zum optischen Multiplexing. Im zweiten Teil wurden rote und grüne, fluoreszierende Quantenpunkten (QD) als Label für einen schnellen optischen duplex LFA zur quantitativen Analyse der Entzündungsbiomarker Interleukin-6 (IL-6) und C-reaktives-Protein (CRP) verwendet. Der Assay ist designed als Sandwich Immunoassay für die gleichzeitige Auswertung von rot (IL-6) und grün (CRP) emittierenden, QD gelabelten Antikörpern gegen die Ziel- Analyten. Wir erreichten damit einen sehr sensitiven Assay, der dabei helfen kann Sepsis und andere inflammatorische Ereignisse zu unterscheiden. Zusammen mit dem Assay erstellten wir die MultiFlow Shiny App und verwendeten diese für die Bearbeitung und das Management der erhaltenen Datensätze. Die App kann für die Auswertung aller Streifen- oder Linien Assays verwendet werden. Sie verfügt über Werkzeuge zur Bildverarbeitung, fortgeschrittene Hintergrundkorrektur und kann Kalibrierungsprofile für eingeschleuste Assays erstellen, welche Kennzahlen wie Limit of Detection (LOD), Limit of Quantification (LOQ) und Limit of Blank (LOB) aus angepassten linearen Modellen berechnen. Die Bildgebung erfolgte dabei durch einen professionellen Labor Imager, welcher mit passenden optischen Emissionsfiltern zur farblichen Trennung der verwendeten Quantenpunkte bestückt war. Der Assay bewies eine hohe Leistungsfähigkeit, aber das komplexe und sperrige Auswertungssystem reduziert das Potential für Point of Care Anwendungen, weil es nicht tragbar ist. Im dritten Teil wurden Quantenpunkte als Label benutzt um einen LFA für die Entzündungs- und Gerinnungsbiomarker IL-6 und Thrombin durchzuführen. Grüne QD Antikörper Konjugate wurden zur Messung von IL-6 benutzt. Zur Detektion von Thrombin wurde jedoch ein Konjugat aus roten QDs und Thrombin bindenden Aptameren (TBA) benutzt. Der Hybrid-Assay kombiniert 2 verschiedene Klassen von 11 Fängermolekülen in einem schnellen Einstufigen LFA, wobei wir über optische duplex Auswertung beide Proteine gleichzeitig bestimmen konnten. Zur Bildgebung wurde ein 3D-gedruckter LFA Imager mit eingebauter UV-LED-Lichtquelle in Kombination mit einem Huawei P30 Pro Smartphone benutzt. Beim Auswerten der Fotos wurden die RGB-Farbkanäle getrennt. Danach konnten die erzeugten Bilder des grünen und roten Kanals direkt zur Quantifizierung von beiden Analyten, IL-6 und Thrombin, genutzt werden. Auch wenn der LOD von IL-6 nicht die gleiche Sensitivität erreichte wie der Sepsis Assay aus Publikation 2, so ist die optische duplex-Auswertung von Smartphone Fotos, insbesondere in Kombination mit unserem 3D-gedrukten, günstigen, und leicht verfügbaren Open-Source Imager ein großer Erfolg um die multiplex Eignung von LFAs zu erhöhen. Die Kombination von Aptameren als Fängermolekülen erschließt zusätzlich neue Möglichkeiten. Der Assay könnte weiterführend mit der Multiflow Shiny App aus Publikation 2 gekoppelt werden, indem zum Werkzeugkasten der App ein RGB-Separator-Modul hinzugefügt wird. Der erforschte Assay erfüllt daher alle Voraussetzungen, um als Muster für künftige, schnelle und günstige multiplex LFAs mit Smartphone Auswertung zu dienen. Das Setup ist dabei besonders geeignet zum Einsatz beim Home-Monitoring oder in Infrastruktur-Schwachen Gebieten.

Lateral flow assays (LFAs) for medical applications are an important tool allowing patients and/or medical professionals to perform rapid and reliable diagnostics directly onsite. Because LFAs provide usable information with a time to result of ≤ 30 min or even as little as 5 min, this diagnostic tool is well suited for applications in precision medicine and point of care (POC) diagnostics, in which rapid results or cost effective drug monitoring are needed. If accurate quantitative results are required, readout hardware is mandatory. Readers should be portable, and ideally inexpensive and easily available. In this regard, smartphones, with their increasing photography capability and computational power, are an excellent choice as readers. Images acquired by smartphones can provide results of similar quality to those of professional laboratory equipment in certain settings. Beyond the imaging hardware, the label, such as commonly used gold nanoparticles (AuNPs), is an essential component in LFAs, determining their sensitivity and multiplexing capabilities. In total, we researched three LFA assays for use in drug monitoring of digoxin or screening of the blood inflammation and coagulation biomarkers C-reactive protein (CRP), interleukin-6 (IL-6) and thrombin and published the results. Progress was achieved in smartphone imaging and optical multiplexing, using green and red quantum dots (QDs) as labels. In the first part, a low-tech smartphone readout system for drug monitoring of cardiac glycoside digoxin was built. Images acquired with an iPhone 5S and a simple darkbox made from black cardboard were processed with a customized Shiny app. The quantitative results were compared with data acquired with a professional laboratory imager, and only minor differences were observed in key assay measures (19.8–16.9 nmol/L limit of detection). The assay is suitable for detecting the clinically relevant range and thus could be used for close interval home monitoring of this potentially toxic drug with a narrow therapeutic window. For the digoxin LFAs, we used spherical AuNPs with 50 nm diameter in a competitive setup. The colorimetric assay is compatible with most commercially available, professional lateral flow readers, because the chosen AuNP dye poses the common standard. The setup demonstrated excellent performance and is suitable for cost effective drug monitoring at patient´s homes or in resource poor areas. However, the use of AuNP dyes without postprocessing steps has limited sensitivity and lacks multiplexing capability. 8 For the second part, we chose red and green fluorescent QDs as labels to achieve a rapid optical duplex LFA for quantitative detection of the inflammation biomarkers IL-6 and CRP. The assay was designed as a sandwich immunoassay for simultaneous readout of red (IL-6) and green (CRP) emitting QD labeled antibodies against the target analytes. We achieved a highly sensitive and rapid POC assay that could aid in distinguishing between sepsis and other inflammatory events. Along with the assay, we created the MultiFlow Shiny app, which was used to process and manage data from our assay but could also be used for easy and rapid data handling of all strip- or line-based assays. The software includes tools for image processing and advanced background correction, and it can generate calibration profiles for assays, including key measures such as the limit of detection, limit of quantification and limit of blank for fitted linear models. Readout was performed with a professional laboratory imager equipped with suitable emission color filters that were matched to the used QD labels. Although the assay performed well, the specialized and bulky readout system limited the potential for POC applications, because of its lack of portability. In the third part, we used QD labels to develop a duplex LFA for the inflammation and coagulation biomarkers IL-6 and thrombin. Green QD antibody conjugates were used for detection of IL-6. For detection of thrombin, however, we used conjugates of thrombin binding aptamers and red QDs for detection of thrombin. The hybrid assay combined two different classes of capture molecules in a rapid single-step assay while achieving optical duplexing for the readout of both target proteins simultaneously. For imaging, a 3D-printed LFA imager with an inbuilt LED UV light source in combination with a Huawei P30 Pro smartphone was used. Images were processed by separation of RGB channels. The generated green and red channel images could then be directly used for quantification of both analytes, IL-6, and thrombin. Although the limit of detection for IL-6 did not attain the achieved sensitivity of the sepsis assay in Publication 2, the optical duplexing from a single smartphone image is a major achievement for enhancing the multiplexing capabilities of LFAs with affordable and easily available readout hardware, such as our open source 3D-printed smartphone imager. In particular, the combination with aptamers as capture molecules enables new possibilities. In the future, the assay could be combined with the MultiFlow Shiny app from Publication 2 by adding an RGB separator module to the toolkit. Therefore, this assay holds promise for further applications in rapid and affordable diagnostic tool based multiplex LFAs for smartphone readout, even in homes or areas with limited 9 resources and infrastructure.