Novel neuro-microphysiological system (nMPS) for multiple characterisations of 3D neuronal networks co-cultured with astrocytes and microglia

Abstract

Neurological disorders constitute over 6% of the global burden of disease and are believed to increase in society over time. Therefore, pharmacy companies aim to develop novel therapies that minimise the effect of such disorders. However, the former has proved challenging as the efficacy and safety issues are not accurately estimated in pre-clinical studies due to the lack of physiologically relevant models. Therefore, neuro-microphysiological systems (nMPS) aim to bridge the gap from the less relevant two-dimensional (2D) in vitro platforms and animal models to three-dimensional (3D) models that mimic more closely the brain's physiological phenomena. Nevertheless, most novel nMPS cannot precisely evaluate neuronal networks or brain structures due to the lack of diverse readouts implemented in their devices. This study presents a novel transparent high-throughput in vitro platform with the capability of simultaneously recording the electrophysiological activity of up to 18 individual 3D neuronal networks through insulating caps on substrate-integrated microelectrode arrays (MEA) (capped microelectrodes, CµE). Additionally, this nMPS allows the characterisation of morphological and proteomic traits. To evaluate the accuracy of this system, multiple readouts were performed. Firstly, the physiological growth of three different brain cells (neurons, astrocytes, and microglia) introduced in the 3D cell culture was corroborated via live-cell imaging and immunocytochemistry (ICC). Secondly, synaptic circuits of the 3D growing neurons were confirmed via calcium imaging, and optogenetics performed simultaneously to electrophysiological recordings. The network's functionality was evaluated using reference compounds picrotoxin (PTX), tetrodotoxin (TTX), and rotenone, demonstrating an exceptional sensitivity and experimental reproducibility among various devices. Furthermore, the application of rotenone demonstrated the toxicity of the compound at lower concentrations and the earlier detection of neuronal alterations by electrophysiological recordings compared to traditional morphological studies, demonstrating the former's superior susceptibility. This sensitivity was corroborated after evaluating the effect of pro-inflammatory compounds interferon-γ (IFNγ) and tumour necrosis factor-α (TNFα) in co-cultured neurons, microglia and astrocytes at a morphological, proteomic and electrophysiological level. In conclusion, a novel, high-physiologically relevant neuro-microphysiological device was developed, which captures the electrical activity of 3D growing neurons in co-culture with astrocytes and microglia with high efficiency and reproducibility by additionally relying on cellular morphological and proteomic characterisation. Through its versatility, this platform qualified as a new standard approach for disease modelling and a new tool for screening of compounds targeting the central nervous system (CNS). This work was funded by the Baden-Württemberg Stiftung GmbH under grant agreement MIVT-7 (NEWRON-3D) and sent for publication to a journal (Molina-Martínez and Jentsch et al., 2021). The second part of this work is being prepared for a further publication.

Neurologische Erkrankungen machen mehr als 6 % der globalen Krankheitslast aus und es wird angenommen, dass sie mit der Zeit in der Gesellschaft zunehmen. Daher ist es das Ziel von Pharmaunternehmen, neuartige Therapien zu entwickeln, die die Auswirkungen solcher Krankheiten minimieren. Ersteres erweist sich jedoch als Herausforderung, da die Wirksamkeit und Sicherheit in präklinischen Studien mangels physiologisch relevanter Modelle nicht genau abgeschätzt werden kann. Daher zielen neuro-mikrophysiologische Systeme (nMPS) darauf ab, die Lücke von den weniger relevanten zweidimensionalen (2D) In-vitro-Plattformen und Tiermodellen zu dreidimensionalen (3D) Modellen zu schließen, die die Eigenschaften des menschlichen Gehirns besser nachahmen. Dennoch können die meisten neuartigen nMPS neuronale Netzwerke oder Hirnstrukturen nicht präzise auswerten, da in ihren Geräten nicht genügend Auslesefunktionen implementiert sind. In dieser Studie wird ein neuartiges transparentes In-vitro-System vorgestellt, das die elektrophysiologische Aktivität von bis zu 18 individuellen 3D-Neuronennetzwerken durch integrierte Mikroelektroden-Arrays (MEA) aufzeichnen kann. Darüber hinaus erlaubt dieses nMPS die Charakterisierung von morphologischen und proteomischen Merkmalen. Um die Genauigkeit dieses Systems zu evaluieren, wurden mehrere Auslesungen durchgeführt. Erstens wurde das physiologische Wachstum von drei verschiedenen Gehirnzellen (Neuronen, Astrozyten und Mikroglia), die in die 3D-Zellkultur eingebracht wurden, mittels Live-Cell-Imaging und Immunzytochemie bestätigt. Zweitens wurden die synaptischen Schaltkreise der in 3D wachsenden Neuronen durch Kalzium-Imaging und Optogenetik bewiesen, die gleichzeitig mit elektrophysiologischen Ableitungen durchgeführt wurden. Die Funktionalität des Netzwerks wurde mit den Referenzsubstanzen Picrotoxin (PTX), Tetrodotoxin (TTX) und Rotenon evaluiert, wobei sich eine außergewöhnliche Sensitivität und experimentelle Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Geräten zeigte. Nach der Anwendung von Rotenon zeigten zusätzliche morphologische Auswertungen dessen Wirkung zu späteren Zeitpunkten im Vergleich zu elektrophysiologischen Ableitungen, was die überlegene Empfindlichkeit der letzteren demonstrierte. Diese Empfindlichkeit wurde bestätigt, nachdem die Wirkung der pro-inflammatorischen Moleküle Interferon-γ (IFNγ) und Tumornekrosefaktor-α (TNFα) in ko-kultivierten Neuronen, Mikroglia und Astrozyten auf morphologischer, proteomischer und elektrophysiologischer Ebene ausgewertet wurde. Schlussendlich wurde ein neuartiges, hochphysiologisch relevantes mikrophysiologisches Gerät entwickelt, das die elektrische Aktivität von 3D wachsenden Neuronen mit hoher Effizienz und Reproduzierbarkeit erfasst, indem es sich zusätzlich auf die zelluläre morphologische und proteomische Charakterisierung stützt. Durch ihre Vielseitigkeit qualifiziert sich diese Plattform als neuer Standardansatz für die Krankheitsmodellierung und als neues Werkzeug für das Screening von Substanzen, die auf das zentrale Nervensystem abzielen. Diese Arbeit wurde von der Baden-Württemberg-Stiftung GmbH unter dem Fördervertrag MIVT-7 (NEWRON-3D) gefördert und an eine Fachzeitschrift mit der Absicht zur Veröfffentlichung geschickt (Molina-Martínez and Jentsch et al., 2021). Der andere Teil der Arbeit wird für eine weitere Veröffentlichung zur Zeit vorbereitet.